【正文】 榛蘑粗多糖工藝優(yōu)化摘 要 本試驗以榛蘑為原料，研究其多糖的提取工藝，通過傳統(tǒng)水提法、超聲波法、酶法、超聲波—酶聯(lián)合提取法四種方法對榛蘑多糖進行提取，根據(jù)單因素和正交試驗的結(jié)果，得到最佳的提取工藝條件。 結(jié)論為超聲波—，具有明顯的優(yōu)勢。The extraction percent of soluble polysaccharides from Arimillaria mellea with enzyme method is %. According to validation experiment, pared with traditional methods, ultrasonic wave bined with enzyme method produced higher extraction percent of soluble polysaccharides(the times of the traditional water bath extraction, times of the ultrasonic wave method extraction, times of the enzyme method extraction ,respectively). Key words：Armillaria mellea。 ultrasonic wave。extraction technology.目 錄摘要Abstract1 緒論 1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 5 52 材料和方法 6 試驗器材 6 試驗儀器 6 試驗材料 6 試驗方法 7 7 葡萄糖標準曲線的繪制 7 7 7—酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖 8 93 結(jié)果與分析 10 10 10 11 11 13 14 14 14 16 17 18 184 結(jié)論 19參考文獻致謝超聲波酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖工藝研究1 緒論 榛蘑為真菌植物門真菌蜜環(huán)菌的子實體。其外型呈傘狀，土黃色，廣泛分布在我國東北地區(qū)，被稱為“東北第四寶” [1]。在人們追求健康飲食的今天，榛蘑由于其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富及出色的藥用功能，受到越來越多人的歡迎[2]。 榛蘑不僅是食材，還可入藥，自古以來一直是一種中醫(yī)藥材，具有清目、利肺、益腸胃及活血化瘀，強筋健骨的功效。經(jīng)常食用可加強肌體免疫力，益智開心，延年輕身等作用，還可以防止皮膚干燥，預防某些心腦血管疾病和呼吸道及消化道疾病[4]。(1)榛蘑多糖的免疫增強作用 大量文獻報道榛蘑多糖具有免疫增強作用，能增強小鼠的免疫能力、促進生長，但對其作用機理闡述得并不完全一致。Li YP[7]等在使用昆明純種小鼠研究榛蘑多糖時發(fā)現(xiàn)，榛蘑多糖對環(huán)磷酰胺引起的小鼠骨髓細胞損傷具有保護作用。于敏等[9]研究結(jié)果表明，AMP 能抵抗環(huán)磷酰胺作用前期白細胞數(shù)下降和環(huán)磷酰胺作用后期白細胞數(shù)過分升高，一定劑量的AMP 能顯著降低肝臟重量，表明其對免疫器官有一定程度的影響。另有報道AMP能在體外顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的作用[11]，并可誘導巨噬細胞產(chǎn)生NO且呈現(xiàn)一定的濃度相關性，在高濃度時，對巨噬細胞分泌IL－1有一定的促進分泌作用。綜合上述，榛蘑多糖是通過調(diào)節(jié)免疫細胞以及免疫分子等多方面發(fā)揮其正向免疫調(diào)節(jié)作用，具有較好的藥用價值，蜜環(huán)菌多糖是否可作為骨髓細胞的保護劑，抗放射，抗化學藥物對骨髓造細胞損傷，是值得深入研究的課題。實驗中，將肝癌細胞SMMC－ 7721進行體外培養(yǎng)，研究AMP的抗腫瘤作用。 采用MTT法檢測蜜環(huán)菌多糖對肝癌細胞SMMC－7221的增殖抑制作用。采用免疫細胞化學法分析其對凋亡相關蛋白bcl－2表達的影響。 ，能夠顯著抑制腫瘤細胞蛋白質(zhì)的合成。榛蘑多糖的抗腫瘤作用不僅在體外實驗中得到驗證，也體現(xiàn)在化學結(jié)構鑒定和體內(nèi)實驗中，經(jīng)紅外光譜檢測，榛蘑多糖具有β－型糖苷鍵，這種構效關系的多糖具有抗腫瘤的藥理活性，并且在對移植S180小鼠進行在體抗腫瘤實驗，也證實其抗腫瘤的作用。能使四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖顯著降低。操玉平等［13］通過培養(yǎng)大鼠胰島素瘤細胞(INS－1) ，并以四氧嘧啶(AXN) 損傷細胞，培養(yǎng)液中加入不同濃度的AMP－1，檢測其對INS－l細胞葡萄糖刺激的胰島素和C 肽分泌量的影響，并檢測細胞存活率。 因此可以得出AMP－l可減少AXN對INS－l細胞的損傷，增加INS－l細胞的存活率。AMP對血糖的作用機制尚不明確。(4)榛蘑多糖的抗氧化及抗衰老作用 榛蘑多糖的抗氧化抗衰老作用近些年來取得較大的研究進展。榛蘑多糖作為蜜環(huán)菌的主要成分之一亦被發(fā)現(xiàn)有此項作用，在研究培養(yǎng)藥用型真菌蜜環(huán)菌抗氧化作用活性時，發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌勻漿提取物榛蘑多糖具有強大的清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用［15］。沈明花［17］等研究結(jié)果顯示榛蘑多糖對羥基自由基和二苯基苦味?；诫戮哂休^顯著的清除能力，甚至可以提高肝組織中的SOD、CAT、GSH－Px活性并且抑制MDA 生成，因而具有明顯的抗氧化作用。丁誠實［19］等通過觀察榛蘑殼聚糖對D－半乳糖致衰老小鼠的影響和對果蠅壽命的影響，測定受試小鼠血清中的SOD活性、MDA的含量以及分析小鼠記憶學習行為等可以得出榛蘑殼聚糖有顯著抗衰老作用。此實驗結(jié)果表明，%%濃度的榛蘑多糖Aml 可以使受試果蠅蛹的孵出率提高，當代及F2代果蠅突變率降低，同時染色體水平上的檢測也證實了此結(jié)論。(6)其他作用 榛蘑多糖具有鎮(zhèn)靜作用，能明顯減少小鼠自發(fā)活動，并能使環(huán)己烯巴比妥鈉或戊巴比妥鈉引起的小鼠睡眠時間顯著延長。在臨床上榛蘑多糖還用于治療肢麻、佝僂病、頸椎病、風濕病、腰腿酸痛，可以強壯筋骨。 水作為溶劑提取多糖是最常使用的一種方法，可以用熱水提取，也可以用冷水浸泡。一般多糖提取大多數(shù)采用熱水提取，得到了多糖可以直接或離心去除不溶物，或利用多糖不溶于高含量乙醇的性質(zhì)，用高濃度酒精沉淀凈化多糖。其特點是產(chǎn)物純度高，質(zhì)量好，特別適用于熱敏性原料，但提取率較溶劑萃取法低[23]。 微波輔助萃取，是使用微波加熱接觸樣溶劑，化合物從要求的樣品分離，進入一種溶劑的過程。 超聲波是指頻率為15KHz～60MHz之間的一種高頻彈性機械波，通常需要介質(zhì)如空氣、水等進行傳播。分散在樣本和溶劑的之間產(chǎn)生的空化效應，小氣泡的形成，增長和爆破壓縮，產(chǎn)生5000℃的高溫和50MPa的局部高壓，從而使固體樣品分散與溶液產(chǎn)生高速碰撞，增大樣品與溶劑之間的接觸面積，從而加速植物細胞內(nèi)目標物轉(zhuǎn)移到溶劑中，提高傳質(zhì)速率[23]。：（1）常溫萃取。（2）常壓萃取。（3）萃取效率高。（4）適用性廣。（5）節(jié)能環(huán)保。（6）其他優(yōu)點，如藥材原料處理量大，雜質(zhì)少，有效成分易于分離、凈化。 植物細胞壁是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠、物質(zhì)構成，通常提取劑添加適量的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和分解的細胞壁,半纖維素、果膠、破壞細胞壁的結(jié)構,加速細胞的有效成分溶出率，提高提取效率，縮短提取時間[23]。 我國榛蘑資源豐富，廣泛生長于我國東北地區(qū)。榛蘑還有著重要的藥用價值，其多糖成分具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、增強免疫力、降血糖等藥理作用，在食品行業(yè)中有著廣泛的應用前景，所以榛蘑多糖引起了許多人的關注，不少科研工作者開始研究榛蘑多糖的提取純化及各種理化性質(zhì)。 榛蘑粉傳統(tǒng)水提 超聲波法 超聲波酶聯(lián)合法 酶法 加酶率酶解溫度酶解時間 PH 料液比超聲功率超聲溫度超聲時間 回流浸提 超聲處理 濃縮除蛋白離心醇沉榛蘑多糖計算提取率2 材料和方法 試驗器材 試驗儀器超聲波細胞清洗器KQ500DE 昆山超聲波儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋DKS12上海森信實驗儀器有限公司臺式低速離心機TDL5W湖南星科科學儀器有限公司恒溫水浴搖床HZSHA哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司循環(huán)水多用真空泵SHB3鄭州杜甫儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE 52A上海亞榮生化儀器廠中草藥粉碎機FW135天津市泰斯特儀器有限公司可見光分光光度計722S上海精密科學儀器有限公司臺秤YP2001N上海精密科學儀器有限公司分析天平JA2003上海良品儀器儀表有限公司pH計PB10Sartorius有限公司電冰箱BCD215KSHaier有限公司 試驗材料榛蘑購于家樂福超市纖維素酶購于美國Sigma公司苯酚分析純天津市瑞金特化學試劑有限公司濃硫酸分析純北京化工廠正丁醇分析純天津市天力化學試劑有限公司鹽酸分析純北京化工廠氫氧化鈉分析純