【正文】 養(yǎng)18～24h。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。，中國(guó)藥品生物制品檢定所制。、霉菌及酵母菌的檢查的菌液制備、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，℃177。，℃177。，℃177。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）至無(wú)菌試管內(nèi)，%（ml/ml）％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用?！媾囵B(yǎng)18～24h，％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含細(xì)菌數(shù)約為10～100cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。: 細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證采用上述供試品，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別人工污染上述5種代表試驗(yàn)菌株。、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)：取上述供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底細(xì)菌數(shù)；取上述供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)；：分別取上述5種試驗(yàn)菌懸液1ml，制備濾膜，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。取1：10供試液1ml，過(guò)濾，沖洗，分別在最后一次的沖洗液中加入白色念珠菌和黑曲霉懸液各1ml，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定霉菌數(shù)。，制成1：10的供試液。取實(shí)驗(yàn)用的稀釋液1ml，制備濾膜，濾膜菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，均不得有菌生長(zhǎng)。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。若同稀釋級(jí)別兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌，細(xì)菌菌落數(shù)。以相當(dāng)于1g供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)，或1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌落數(shù)。取1：10供試液10ml，制備濾膜，濾膜接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出大腸埃希菌。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作為本底對(duì)照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。7異常情況處理嚴(yán)格按照《微生物限度檢查法SOP》操作，如在檢測(cè)中出現(xiàn)不符合要求的情況出現(xiàn)，分析問(wèn)題原因后，決定是否需對(duì)本方案中設(shè)定的******的微生物限度檢查方法進(jìn)行修改，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。9結(jié)論《******檢驗(yàn)操作規(guī)程》，我們?cè)O(shè)定了該產(chǎn)品的微生物限度檢驗(yàn)方法，對(duì)******批******進(jìn)行了微生物方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，證明該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 檢驗(yàn)需要， GMP要求， 使用。確定******微生物限度檢查法如下： 質(zhì)量負(fù)責(zé)人： 審核人： 檢驗(yàn)人10再驗(yàn)證周期******的處方發(fā)生變動(dòng)或其它因素變更導(dǎo)致******的物料性質(zhì)改變時(shí)，需要對(duì)本方案進(jìn)行調(diào)整后作方法學(xué)再驗(yàn)證。11附表附表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果 試驗(yàn)分類實(shí)驗(yàn)次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌試驗(yàn)組123菌液組123稀釋劑對(duì)照組123供試品對(duì)照組1供試品對(duì)照組2供試品對(duì)照組3陰性對(duì)照組1陰性對(duì)照組2陰性對(duì)照組3稀釋劑對(duì)照組菌回收率223試驗(yàn)組的菌回收率123結(jié)果判定備注：******驗(yàn)證一批平行三次，批號(hào)：******結(jié)論：按照《******微生物限度檢查法驗(yàn)證方案》檢驗(yàn)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)日期： 報(bào)告日期： 檢 驗(yàn) 人： 復(fù) 核 人： 質(zhì)量部QA: 統(tǒng)計(jì)日期： 附表2：控制菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果品名： 批號(hào)： 試驗(yàn)次數(shù)項(xiàng)目BL增菌液MUG靛基質(zhì)檢查結(jié)果結(jié)果判定第一次供試品　　　　　　試驗(yàn)組　　　　陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照　　　　第二次供試品　　　　　　試驗(yàn)組　　　　陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照　　　　第三次供試品　　　　　　試驗(yàn)組　　　　陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照　　　　檢 驗(yàn) 人： 復(fù) 核 人： 質(zhì)量部QA: 統(tǒng)計(jì)日期： 附表3：按確定的驗(yàn)證方法檢驗(yàn)三批產(chǎn)品微生物限度檢查結(jié)果 品名： 項(xiàng)目 細(xì)菌數(shù)霉菌和酵母菌數(shù)大腸埃希菌批號(hào)　cfu/gcfu/g　　cfu/gcfu/g　　cfu/gcfu/g　檢 驗(yàn) 人： 復(fù) 核 人： 質(zhì)量部QA: 統(tǒng)計(jì)日期： 微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案 編碼：表一、驗(yàn)證方案的起草與批準(zhǔn) 起草人： 起草時(shí)期： 年 月 日： 部門審核人日 期生產(chǎn)部生產(chǎn)車間QCQA 批準(zhǔn)人： 批準(zhǔn)日期：二、驗(yàn)證方案為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測(cè)定，特制定本方案。通過(guò)比較試驗(yàn)4組中試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長(zhǎng)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)整個(gè)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。試驗(yàn)菌應(yīng)包括G—、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。：用標(biāo)準(zhǔn)菌株評(píng)價(jià)方法“ ”的微生物限度檢查對(duì)檢品中微生物的抑制性，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)顯示3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗(yàn)組回收率也不低于70%。：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過(guò)濾層裝置。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)該保持對(duì)環(huán)境形成正壓。 實(shí)驗(yàn)菌株的來(lái)源： 菌株名稱內(nèi)控編號(hào)大腸埃希菌CMCC(B) 44102Ec金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501Bs白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca黑曲霉CMCC(F) 98003An編號(hào)由菌名首字母—傳代代數(shù)—制備日期組成。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在23～28℃下培養(yǎng)5～7天。供試液的制備：取樣品10g（ml），振搖使分散均勻□，或用勻漿儀混勻□，制成1：10均勻的供試液。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。C供試品對(duì)照組取上述1：10供試液1ml注入平皿中，分別傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。： 批號(hào)： 菌種名稱產(chǎn)品試驗(yàn)組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉： 批號(hào)： 菌種名稱供試品對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉： 批號(hào)： 菌種名稱稀釋劑對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉： 批號(hào)： 菌種名稱菌液組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種名稱批號(hào)菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）回收率稀釋劑對(duì)照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)247。菌種名稱批號(hào)菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）回收率試驗(yàn)組供試品對(duì)照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）247。：，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為 %、 %、 %、 %、 %。 以上驗(yàn)證結(jié)果證明，本品 采用上述方法進(jìn)行微生物限度檢查。驗(yàn)證委員會(huì)負(fù)責(zé)對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)審，做出驗(yàn)證結(jié)論，發(fā)放驗(yàn)證證書。驗(yàn)證報(bào)告由驗(yàn)證組長(zhǎng)審核后，報(bào)驗(yàn)證總負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)，并簽發(fā)驗(yàn)證證書。驗(yàn)證方案各項(xiàng)性能指標(biāo)在驗(yàn)證中未作變動(dòng)，誤差在允許范圍內(nèi)。驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)計(jì)要求和GMP原則要求，可以投入使用。以上情況，請(qǐng)驗(yàn)證委員會(huì)審批！驗(yàn)證小組：年 月 日試驗(yàn)報(bào)告審批表驗(yàn)證名稱微生物限度檢查方法驗(yàn)證編號(hào)SOPV028驗(yàn)證內(nèi)容審閱會(huì)簽質(zhì)量部審核人： 年 月 日驗(yàn)證委員會(huì)意見(jiàn)：批準(zhǔn)人： 年 月 日驗(yàn)證證書 驗(yàn)證證書編號(hào)：