雙向電泳技術(shù)ppt課件-在線瀏覽
2025-06-29 06:43本頁面
【正文】 TEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。 ?與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應(yīng)，生成 β 芳氧基或烷氧基丙酰胺。 ?與一些硫醇反應(yīng)，生成 β 烷基丙酰胺。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。 聚丙烯酰胺凝膠的 有效孔徑 ： 17 18 濃縮效應(yīng) 19 聚丙烯酰胺凝膠電泳的異常現(xiàn)象及解決辦法 20 第二節(jié) 蛋白質(zhì)等電聚焦電泳 1966年，瑞典科學(xué)家 Rible和 Vesterberg建立。 ，當(dāng)通直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的 pH梯度。 ：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定蛋白或多肽的等電點。 21 利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點的不同，在一個 穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的（或非線性） pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。 根據(jù)建立 pH梯度原理不同，可分為 載體兩性電解質(zhì) pH梯度（ carrier ampholyte pH gradient)和 固相 pH梯度 (immobilized pH gradient, IPG)。 組成每一種蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的數(shù)目和比例是不同的，故蛋白質(zhì)的等電點范圍很寬，這使得可以利用它來分離和分析蛋白質(zhì)。 ② 在等電點處有足夠高的電導(dǎo)，以便使一定的電流通過，具備不同 pH的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，是整個體系中的電導(dǎo)均勻。 ④ 化學(xué)組成不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。 由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備 (有不同 pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體 ) 25 載體兩性電解質(zhì) pH梯度的形成 有兩種方法產(chǎn)生 pH梯度： 用兩種不同的 pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成 pH梯度。人工 pH梯度。天然 pH梯度。 載體兩性電解質(zhì)的缺點 ① 載體兩性電解質(zhì)合成過程復(fù)雜，影響蛋白質(zhì)點的位置，從而影響了重復(fù)性； ② 負(fù)極漂移現(xiàn)象，使 pH梯度不穩(wěn)定； ③ 負(fù)極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無法聚焦； ④ 凝膠灌制重復(fù)性差，凝膠機(jī)械穩(wěn)定性差，影響重復(fù)性。 ④ pH梯度測定：電泳結(jié)束后，用微電機(jī)檢測凝膠表面 pH。添加表面活性劑。固相 pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到 ，是目前分辨率最高的電泳方法之一。 29 固相 pH梯度的建立 固相 pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要歸功于 Immobilines試劑（ Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相 pH梯度（ IPG）技術(shù)。每個分子都有一個單一的酸性或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為： 其中 R代表羧基或第三氨基。所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。 所以固相 pH梯度與載體兩性電解質(zhì) pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成 pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成 pH梯度。 固相 pH梯度可窄至 ，因此分辨率極高，可達(dá) ； pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇 pH梯度和斜率；重復(fù)性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾小；對堿性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無邊緣效應(yīng)，故可用很窄的膠條（如 5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相 pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時候需要高電壓，電泳時間長，窄范圍 pH測定困難，只能計算。 32 加樣方式 33 等電聚焦電泳進(jìn)行過程中 等電聚焦電泳結(jié)束后 （－） （－） 高 pH 高 pH 低 pH 低 pH 34 第三節(jié) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 一、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 基本原理 :天然狀態(tài)生物大分子聚丙烯酰胺凝膠電泳（ native PAGE） ,在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中分離蛋白質(zhì)。 35 連續(xù)電泳 不連續(xù)電泳 濃縮效應(yīng) 凝膠層 緩沖液離子成分 pH 電位梯度 濃縮效應(yīng) 電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 36 影響凝膠聚合的因素 ① 形成凝膠試劑的純度 ② 凝膠濃度 ③ 溫度和氧氣的影響： 2325℃ 聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點 37 二、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 基本原理 ① 聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。 ③ 分離測定： ④ 測分子量 (與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較 ) ⑤ 鑒定樣品純度 (條帶數(shù)目 ) ⑥ 測定樣品蛋白含量：掃描定量 (比色 ) 38 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響因素 ① 溶液中 SDS單體的濃度 ② 二硫鍵是否完全還原 ③ 緩沖系統(tǒng)的選擇 ④ 凝膠濃度的選擇 39 凝膠電泳的操作要點
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