生物分離工程第八章電泳技術(shù)-在線瀏覽
2025-03-05 11:54本頁面
【正文】 ，離子尺寸越大、溶液中的離子強(qiáng)度越高時(shí)，電泳現(xiàn)象變得越明顯。 電泳的簡單原理 ?蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的 H+濃度或與其它大分子的相互作用。 Stoke’s Law（斯托克斯定律） ? 如果把生物大分子的膠體溶液放在一個(gè)沒有干擾的電場中，使顆粒具有恒定遷移速率的驅(qū)動力來自于顆粒上的有效電荷 Q和電位梯度 E，它們與介質(zhì)的摩擦阻力 f相抗衡，這種抗衡服從斯托克斯定律： ????????? ??是介質(zhì)粘度為 η中半徑為 r的顆粒的移動速度 。 電泳遷移率 ?電泳遷移率（ mobility） :在電位梯度 E的影響下，帶電顆粒在時(shí)間 t中的遷移距離 d。sec1 區(qū)帶電泳的主要技術(shù) ?區(qū)帶電泳中的常用技術(shù) –載體電泳：粉末電泳、紙電泳、 凝膠電泳、聚焦電泳 –無載體電泳：自由電泳、 毛細(xì)管電泳 凝膠電泳 ? 作為電泳支持介質(zhì)必須具有：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性。 ? 該引發(fā) 增速的催化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)是自由基催化的氧化 還原過程。 ? 系統(tǒng) pH值 ：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個(gè)最佳 pH值，以獲得最佳的聚合結(jié)果； ? 溫度 ：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性； ? 分子氧 ：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣 ? 系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合； 聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應(yīng) ? 在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴(kuò)散減到最小。 A B C + 瓊脂糖凝膠 的性能、結(jié)構(gòu)與特點(diǎn) 其優(yōu)點(diǎn)如下： ? 瓊脂糖凝膠孔徑較大 ， %瓊脂糖的孔徑為 800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。 垂直電泳槽及灌膠模具 電泳的一般過程 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理： ? 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴(kuò)散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級， 能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應(yīng) 。 ? PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳 電泳前的準(zhǔn)備工作 ?緩沖系統(tǒng)的選擇： –保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持； –電泳時(shí)間和分辨率：從理論上講 PAGE可以在任何 pH進(jìn)行，但實(shí)際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。 緩沖系統(tǒng)的選擇原則 ?是兩種標(biāo)準(zhǔn)的對立權(quán)衡 – 如果緩沖液的 pH選擇在遠(yuǎn)離樣品中各種蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時(shí)間短，區(qū)帶細(xì)而窄； – 如果緩沖 pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇 pH ~，常用的緩沖液有 Tris甘氨酸（ pH ~
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