蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測(cè)定-在線瀏覽
2025-06-19 13:42本頁(yè)面
【正文】 PITC)試 劑耦聯(lián)后，與其緊鄰的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容 易斷裂。緊挨的 第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的 α— 氨基，又可與 PITC進(jìn)行 耦聯(lián)反應(yīng)。 四、 PTH— 氨基酸的鑒定 可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及 質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。通常選用 C— 18反 相柱進(jìn)行分離。 1978年 Tarr 等將一種四級(jí)銨鹽聚合物“ polybrene”引入了蛋白質(zhì)、多肽的序列測(cè) 定，它能和肽鏈中的極性基團(tuán)作用 (非共價(jià)鍵合 )而將蛋白質(zhì)和多肽有效 地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時(shí)樣品的損失。此儀器較之以前幾種序列 儀具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)： ①靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需 50～ 100pmol； ②試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的 l／ 10，降低了費(fèi)用； ③縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。另外，由于載有活性基團(tuán)的功能性 PVDF膜的問(wèn)世， 蛋白質(zhì)和多肽可以共價(jià)固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進(jìn)行 固相序列分析。這兩臺(tái)儀器統(tǒng)一 用電腦控制，包括化學(xué)反應(yīng)和分析鑒定以及數(shù)據(jù)的自動(dòng)記錄和處理。由圖可見，欲在 20min內(nèi)將各組分 較好分離，需選擇合適的色譜條件，表 別組分位置的遷移及圖譜的改善。這是 由于 Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可 能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。因此，經(jīng)過(guò) 50次循環(huán)后， PTH— 氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰， 影響正確辨認(rèn)，也就是說(shuō)對(duì)于一般蛋白質(zhì)最多能分析至 N端第 50個(gè)氨基 酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)降解成一系列肽段分析后再拼接。 ② 循環(huán)至 Ser和 Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低，這是因?yàn)樵谶M(jìn)行這兩個(gè)氨基酸殘基 分析前一個(gè)循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與 Ser和 Thr上的羥 基反應(yīng)，繼而部分封閉 Ser和 Thr的 N端 — 氨基。 耦聯(lián)試劑 PITC本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有 過(guò)多的 Ser、 Thr、 Glu、 Trp等氨基酸殘基，也將降低這兩個(gè)數(shù)值。 C端測(cè)序尤其適合于基因重組蛋
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