【正文】 還原酶已被分離、純化和商業(yè)銷售。蛋白質(zhì)含量高達(dá) 50％左右 (干粉 )，相當(dāng)于全脂奶粉的 2 倍 [3]。 鹽藻內(nèi)蛋白質(zhì)中氨基酸的比例，基本符臺(tái)聯(lián)合國糧農(nóng)組織 FAO 營養(yǎng)全面食品的標(biāo)準(zhǔn)，即必需氨 基酸與總 氨 基酸的比例在 40% 至 60% 。 本試驗(yàn)研究意義及前景 我國海藻資源豐富，其中有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海藻就有 100多種，是一種開發(fā)利用前景廣闊的海洋資源。今后研究的重 點(diǎn)應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面：①應(yīng)大量選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)量、含生物活性物質(zhì)的品種，利用生物工程技術(shù)加快培育品種的步伐，大力發(fā)展飼用海藻生產(chǎn)。應(yīng)用酶解 工 藝是今后發(fā)展海藻飼料業(yè)的一種很有希望的加工工藝，還有待于繼續(xù)深入研究，開發(fā)更好的提取方法。如何進(jìn)行科學(xué)配伍也是一個(gè)難題，在生產(chǎn)中要有針對性地科學(xué) 選擇海藻種類進(jìn)行合理的配伍，才能發(fā)揮其特殊功效，達(dá)到安全高效 [8]。 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 4 頁 共 16 頁 表 2 鹽藻的氨基酸含量 氨基酸 干藻團(tuán)（ 40%蛋白質(zhì)） g/100g蛋白質(zhì) 去甘油和β胡蘿卜素后的干物 質(zhì)（ 70%蛋白質(zhì)） g/100g 丙氨酸 精氨酸 天門冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酸 甘氨酸 組氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 懶氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 絲 氨酸 蘇氨酸 色氨酸 纈氨酸 脯氨酸 酪 氨 酸 2 材料與方法 實(shí)驗(yàn) 材料 實(shí)驗(yàn) 原 材料 鹽藻 (DunalieUa Salina)由中國海洋大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制作 用電子天平準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白 20mg，放入燒杯中，用蒸餾水溶解后倒入 100mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至 100mL 刻度處，即制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，濃度為 。并繪制 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線 如圖 1 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 6 頁 共 16 頁 表 3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制 管號(hào) 對照 1 2 3 4 5 (ml) 0 蒸餾水 (ml) 0 加入的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度 (mg/ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 3 3 A595nm 0 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線 y = 4 . 7 2 1 4 x0 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 00 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5蛋白質(zhì)濃度 / m g / m LA595 圖 1 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白的吸光度與蛋白質(zhì)濃度曲線 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的獲取與含量測定 (1)鹽藻生長培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。光照與黑暗的比為 12h： 12h。培養(yǎng) 15d 后，進(jìn)行 胞外蛋白質(zhì)提取。 (3)將取得的藻液離心（ 4000r/min,20min）。 (4) 將離心取得胞外蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán) G250 定量測蛋白質(zhì)法 [7]。 （ 5）利用 紫外可見光光度計(jì) 在 A595nm 下測得 1， 2， 3 組的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出相應(yīng)的點(diǎn)，并求出鹽藻胞外蛋白質(zhì)的濃度。從冰箱中取出預(yù)冷 24h 的丙酮，按與鹽藻上清液 1： 1 的體積緩慢加入 500mL 到燒杯中，并不斷用玻璃棒攪拌。 （ 7） 2h 后，從冰箱中取出燒杯。 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 7 頁 共 16 頁 表 4 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量測定 的溶液配制 管號(hào) 對照 1 2 3 蒸餾水 (ml) 0 0 0 蛋白溶液 (ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的 薄板層析與 Rf 值的測定 （ 1）用洗衣粉清洗玻璃板 4 12cm 和 15 cm 各兩塊，然后用蒸餾水沖洗，晾干待用。待羧甲基纖維素鈉充分溶解后，再加入 14g 硅膠 G 粉，最后加入 25mL 蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，直至糊狀。 （ 4）將干燥的薄層層析板放入烘箱內(nèi) l10℃活化 15min 置于干燥器中保存?zhèn)溆?。 由于后面的電泳實(shí)驗(yàn)需要對薄板上分離的蛋白質(zhì)做定性分析，因此薄板的厚度要做的盡量厚一些，約 ～ 1mm。 （ 6）從冰箱中取得制備的蛋白質(zhì)沉淀，化凍，溶解。 （ 8）配制層析液：按照正丁醇：冰醋酸：蒸餾水 4： 1： 1 的比例依次向燒杯加入正丁醇 20ml, 冰醋酸 5ml, 蒸餾水 5ml，攪拌均勻，并倒入層析缸中。 用毛細(xì)滴管吸取 配制樣品溶液 ，輕輕劃在起始線上， 待干后再劃一道，如此重復(fù) 10～ 20 次即可，劃線不可太粗，控制在 2mm 左右。 （ 10） 將點(diǎn)樣后的薄層板，置于裝有展開劑的展層缸中，每只缸裝兩塊薄層板，傾角15 度，嚴(yán)密封口，進(jìn)行展開。 將 薄層板 放在干凈、通風(fēng)的水平工作臺(tái)上 30min,讓其自然干燥。 （ 12）將顯色劑茚三 酮置于玻璃噴霧器中，均勻噴在展開后的層析板上。 （ 13）記下紫紅色斑點(diǎn)與所 劃線的距離記做 X， 層析液前沿 與所 劃線的距離記做 Y。 （ 14）用刀片將紫紅色的斑點(diǎn)取下，置于試管中，加入 1mL 蒸餾水，搖勻，用離心機(jī)離心（ 4000r/min,10min） ,取上清液，保存與 EP 管中，待用。 SDS 在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解 。 （ 3）配制 10%AP（ W/V）： 用電子天平 稱 取 AP1g 置于燒杯中 ，加重蒸水至 10mL，攪拌均勻 。 （ 4）配制 樣品溶解液：內(nèi)含 1%SDS， 1%巰基乙醇， 40%蔗糖， %溴酚藍(lán)， 先配制 L 1 HCl，調(diào) pH 至 ，最后用重蒸水定容至 100mL。L1TrisHCl 加重蒸水至最后總 體積為 100mg 2mg 4g 2ml 10ml （ 5） 配制 30%分離膠貯液： 用電子天 平 稱 取 丙烯酰胺 （ Acr） 30g 和 N, N’亞甲雙丙烯酰胺 (Bis)， 置于燒杯中，加入適量 重蒸水 溶解 ， 用玻璃棒引流至 100 ml 的容量瓶中， 最后定容至 100ml，過濾后置 于 棕色試劑瓶中， 4℃ 貯存 ，待用。 （ 7） 配制分離膠緩沖液（ L1 HCl 48mL，調(diào) 節(jié) pH至 ， 用玻璃棒引流至 100 mL 的容量瓶中， 最后加重蒸水定容至 100mL， 4℃貯存 ，待用。L1 TrisHCl 緩沖液）： 用電子天平 稱 取三羥甲基氨基甲烷（ Tris） ， 置于燒杯中， 加少許重蒸水使其溶解，再加 1mol 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 9 頁 共 16 頁 （ 9） 配制電極緩沖液（內(nèi)含 %SDS， L1 甘氨酸緩沖液 ）：稱 ，甘氨酸 ，加入 SDS 1g，加重蒸水使其溶解后定容至 1000mL。 （ 11） 配制 脫色液： 冰乙酸 75mL， 乙 醇 50mL，加重蒸 水定容至 1000mL。通過硅膠帶將兩塊玻璃板緊貼于電泳槽 (玻璃板之間留有空隙 )，兩邊用夾子夾住。沿長玻璃板壁緩緩注入，約 3~4mm高，以進(jìn)行水封。 （ 14）按表 6 配制 5ml %的 濃縮膠，混勻后，用細(xì)長頭的滴管將凝膠液加至已聚合的分離膠的上方，輕輕的將電泳梳子插入到濃縮膠內(nèi)，約 20min 后凝膠聚合，小心的拔取電泳梳子，用窄濾紙條吸去凹槽中多余的水分， 將 膠條取出，凝膠板換面 ， 將 Tris— 甘氨酸 電極 緩沖液 倒入電泳槽內(nèi)，應(yīng)沒過短板 ,即可準(zhǔn)備加樣 。 （ 16）加樣： 用微量 注射器取樣 10μ L，加入樣品槽 5， 6， 7， 8中，同時(shí)在 4號(hào)槽中加入10μ L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量如表 7。 表 7標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 分子量 (KD) 兔磷酸酶 牛血清蛋白 卵清蛋白 碳酸酐酶 溶菌酶 （ 17）電泳：連接電源，打開電泳儀，開始時(shí)電流為 10mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為30mA，當(dāng)染料前沿至橡膠框底邊 處，大約 3h30min,停止電泳 ，關(guān)閉電源。 取出凝膠板，用蒸餾水沖洗數(shù)次，再用脫色液浸泡， 換脫色液 3 次， 大約 24h，