【正文】 2. 轉(zhuǎn)入萃取筒中，加 95%乙醇至 40mL 刻度處，進(jìn)行清洗。 用少量的石油醚（ 5mL）清洗燒瓶，然后將液體倒入圓筒中。 3. 蓋上瓶塞，劇烈搖動至少 1分鐘。用玻璃虹吸管將上層溶液盡可能地戲出，避免吸入下層溶液（見注解 1）。 5. 使用相同數(shù)量的石油醚（ 50mL）進(jìn)行重復(fù)萃取，至少 6 次。 6. 使用 25mL 的含有 10％乙醇的蒸餾水，將分液漏斗中的萃取物清洗 3 次，劇烈搖動。避免吸出石油醚層。（見注解 3）。水浴蒸發(fā)至干燥，過程中緩慢地注入一股清潔、干燥的氮氣。在干燥器中冷卻，稱量。 8. 在稱量后，將殘余物溶解在 50mL 的 95％乙醇溶液中，該溶液的溫度為 50℃，滴加有酚酞指示劑，并預(yù)先進(jìn)行了中和。校正殘余物的重量（注解 3），使用下面的關(guān)系得出游離脂肪酸的含量： NaOH等于 油酸。同時應(yīng)該對試劑進(jìn)行空白校正。在計算式中用“ C”代表所得到的數(shù)值。 1985～ 1986 年間開展了 Smalley 樣品檢查計劃，下表中的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值（ SR），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分?jǐn)?shù)（ RSD％）和再現(xiàn)性參考了該計劃所得出的結(jié)果（參見AOCS List R 489 in Section R of Official Method）。 樣品 分析編號 異常值 不皂化物的平均百分含量％ SR RSD％ R 1 49 2 2 51 3 3 47 0 4 47 2 5 47 2 注解 警告： 醇 （乙醇）易燃。 氫氧化鉀，如同所有堿一樣，可以嚴(yán)重的灼傷皮膚、眼睛和呼吸道。使用性能良好的通風(fēng)裝置，或防毒面具，以保護呼吸道受到堿性粉塵，或蒸氣的傷害。與水混合時，堿會釋放出大量的熱量，造成容器的破裂。 石油醚極度易燃。在空氣中的爆炸極限為 1～ 6％。 編號注解 1. 可以用一個 500mL的分液漏斗代替萃取筒，從而可以不再使用虹吸管。按照步驟 5 描述的那樣，用石油醚重復(fù)對含水相進(jìn)行萃取，所有的石油醚萃取物在第一個分液漏斗中混合。按照步驟 7，再進(jìn)行一次萃取，然后單獨蒸發(fā)該萃取物，就可以判斷是否達(dá)到了要求。如果有，用少量的石油醚進(jìn)行溶解，然后再倒入上述的萃取混合物中。 3. 樣品未提純時，通 過滴定得到的萃取游離脂肪酸和其它的可萃取不皂化雜質(zhì)（都被稱為油酸）的校正值會增大。 從歷史上，在 AOCS 方法中，是通過滴定不皂化殘余物來確定可萃取游離脂肪酸的校正值。通過 GLC 測量不皂化殘余物中游離脂肪酸的總含量，就可以證明這一點。 商用油脂的取樣和分析 P07～ P11 使用高效液相層析法（ HPLC）方法測定植物油脂中生育酚和生育三烯酚的含量 定義：該方法描述了使用高效液相層析法（ HPLC）方法測定植物油脂中生育酚和生育三烯酚的含量的步驟。但是，可以測定從這些產(chǎn)物中得到的不皂化物的生育酚含量（注解 2 和參考資料 1）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)生育酚溶液的色譜可以確定所有生育酚的校準(zhǔn)因子。油脂中的生育酚和生育三烯酚含量通過一定的步驟進(jìn)行測定，以μ g/g表示。使用一個熒光檢測器，激發(fā)波長為 290nm，發(fā)射波長為 330nm。 2. HPLC 分析柱－ 250 4mm，填充物為微小的氧化硅顆粒，平均粒徑大約為 5μ m（注解 3）。 4. 旋轉(zhuǎn)式薄膜蒸發(fā)器 試劑 注解－所有的溶劑應(yīng)為 HPLC 級別，或同類級別的其它溶劑。 1. α 、β 、γ 和δ 生育酚標(biāo)準(zhǔn)樣品（注解 4）。 3. 二氯甲醇。 5. 異丙醇。 取樣 1. 配制試樣的實驗室樣品必須按照認(rèn)可的取樣步驟（例如， ISO5555）制備。 步驟 1. 生育酚樣品溶液的配制－ (a) α 生育酚標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液 — 按下面的方法制備α 生育酚的儲備溶液：準(zhǔn)確稱量大約 10mg樣品（試劑 1），倒入容量為 100mL 的量瓶，然后加入正己烷（試劑 4），直至滿刻度。然后使用旋轉(zhuǎn)式薄膜蒸發(fā)器（裝置4）移除全部的正己烷，過程中溫度不能高于 40℃。商用油脂的取樣和分析 當(dāng)所有溶劑都被移去后，馬上將燒瓶從蒸發(fā)器中取出。 在 292nm 波長（入射光）下，測定該溶液的吸光度，然后用 除該數(shù)值即得到濃度（μ g/mL， α 生育酚 ）。按照以下的波長測定各溶液的吸光度，并使用相應(yīng)的除數(shù)因子（注解 5）計算物質(zhì)的濃度。用正己烷稀釋，得到操作溶液，其中每個生育酚的含量為 1～5μ g/mL。重要的是，所有的標(biāo)準(zhǔn)樣品都要置于陰暗處，冷藏。在泵的作用下，異丙醇 /正己烷流動相以 1mL/min 的流率在分析柱中至少流動 30 分鐘。如果需要，調(diào)整流動相中異丙醇的含量和流率（注解 8）， 以達(dá)到以下的狀態(tài)： (a) α 生育酚的保留時間不低于 5 分鐘； (b) 分離器對β 和γ 生育酚的分辨率不低于 。 將檢測器和積分儀的靈敏度，以及記錄紙速調(diào)至最佳。不斷注射，直到出現(xiàn)可重復(fù)色譜圖。如果使用固態(tài)實驗室樣品，將有代表性的部分（也就是，重量含量不低于 10％的實驗室樣品）加入到玻璃燒杯中。實際操作中，試樣的制備應(yīng)在柔光下進(jìn)行，無論如何要避免陽光直接照射。加入一定量的正己烷（試劑 4），打旋，使樣品溶化，然后再加入正己烷，至滿刻度。重要的是，在進(jìn)行分析以前，試液應(yīng)置于陰暗處，并且最好在制備當(dāng)天就進(jìn)行分析。如果沒有積分 儀，就記下色譜峰的高度（ mm）。記下生育酚色譜峰的面積（或峰高）。應(yīng)進(jìn)行重復(fù)注射。 6. 測定的數(shù)值－快速演替的進(jìn)行兩次測定（都包括使用制備好的試液進(jìn)行重復(fù)注射），每次測定都要使用現(xiàn)制的試液。 3. 使用相應(yīng)生育酚的 C 值和 A 值可以估算樣品中的生育三烯酚含量（見注解 13）。如果重復(fù)性要求沒有被滿足，需要再對試樣進(jìn)行兩次測定。另外， 4 次結(jié)果的中位值，即兩個 中間值的平均值，也可以作為最終的結(jié)果。 精度 1. 表 1 中列出了一個國際性的實驗室間研究所得出的統(tǒng)計結(jié)果。然后將所得的數(shù)值進(jìn)行平均，得到的數(shù)值不超出表 1 中給出的范圍。 3. 再現(xiàn)性－使用不同裝置，在不同的條件下，兩個不同實驗室的實驗員對一個實驗室樣品進(jìn)行測定。兩次測定的數(shù)值間的差值不應(yīng)大于再現(xiàn)性數(shù)值（ R）（見注解 14），在表 1中使用直線內(nèi)插法可以減小這個差值。職業(yè)安全與衛(wèi)生條例（ OSHA）建議，在一個時間平均數(shù)中的濃度不應(yīng)超過 350ng/M3。應(yīng)在通風(fēng)良好的通風(fēng)櫥中使用。在通風(fēng)良好的情況下進(jìn)行加熱和蒸發(fā)操作。在通風(fēng)良好的情況下使用。 二乙 醚，高度易燃，靠近火源，或火焰時，會發(fā)生劇烈的燃燒和爆炸。光直射可以使之形成過氧化物，并引起爆炸。空氣中爆炸極限是 ～ 48％， TLV 是400ppm。 編號注解 1. 推薦使用含有低溫皂化步驟的方法（參見注解 2）制備不皂化物。 2. 對含有額外生育酚酯的樣品進(jìn)行低溫皂化－ 試劑 （ a） 乙醇－近似 96％純（見注解 警告）。 （ c） 連苯三酚。 （ e） 二乙醚－不用事先氧化，含有 ％（ m/m）的連苯三酚（見注解 警告）。 （ g） 硫酸鈉－無水 步驟 （ a） 準(zhǔn)確稱量大約 2g準(zhǔn)備好的樣品（見取樣部分），倒入容量為 100mL 的平底燒瓶中，使用大約 8mL的乙醇【注解 2，試劑（ a）】，將溶化了的樣品徹底分散，過程中進(jìn)行緩慢地打旋。使用氮氣吹掃燒瓶，加入 4mL 的氫氧化鉀溶液【注解 2，試劑（ d）】 ，再用氮氣進(jìn)行吹掃，并蓋上玻璃塞子。過程中需避免陽光照射，使用棕色玻璃容器保存，或用鋁箔包裹。使用 50mL的二乙醚【注解 2，試劑（ e）】清洗燒瓶，并將洗液倒入分液漏斗中。待各層分離，移出下層的含水萃取層。 （ c） 先用 50mL 水（仔細(xì)搖動以避免乳化），然后用 30mL 稀釋鹽酸【注解 2，試劑（ f）】清洗二乙醚萃取物。使用隔離試紙過濾二乙醚萃取物，然后將濾液倒入一個圓底、棕色旋轉(zhuǎn)式汽化器燒瓶中。如果燒瓶商用油脂的取樣和分析 中有液態(tài)殘留物，加入乙醇【注解 2，試劑（ b）】，然后再蒸發(fā)，直至干燥。將準(zhǔn)備好的試液（主體方法，步驟 4中所描述的）適當(dāng)稀釋，然后進(jìn)行第五步（主體方法）。 4. 可以從 Merck購買到β 、γ 和δ 生育酚標(biāo)準(zhǔn)樣品。據(jù)報道，一些市場上可買到的生育酚的純度在 85～ 100％之間（參考資料 2）。 5. 生育酚所采用的除數(shù)因子來源于參考數(shù)目 3 中給出的數(shù)值 E（ 1％ /1cm）。 6. 標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液應(yīng)保存在棕色的低光化玻璃器皿中，如果冷藏，則可保存一周。最重要的是，應(yīng)避光保存。 8. 適宜的流動相流率范圍是 ～ 。使用紫外線（ UV）檢測器時，必須避免流率過高。按照下式計算效率（ n），板 /米： 2 ?????????hwRdn 式中： 3Rd ＝δ 生育酚的保留距離 hw ＝在 50％高度處的峰寬 10. 分析加工產(chǎn)物，如人造黃油，和含有額外生育酚酯的樣品時，在進(jìn)行層析以前，必須進(jìn)行低溫皂化。注解 2 中描述了皂化過程。它可以被用于試樣色譜的峰鑒定。以下是典型的相對保留時間： 商用油脂的取樣和分析 α 生育酚＝ β 生育酚＝ δ 生育酚＝ γ 生育酚＝ 圖 1 顯示了生育酚和生育三烯酚的流出順序。但是，在報告結(jié)果時，應(yīng)予以說明。 13. 按照參 考文獻(xiàn)，生育三烯酚和其對應(yīng)的生育酚具有同樣的熒光強度（見參考資料4），和相似的 UV吸光度（參考資料 3）。如果按所述的步驟繼續(xù)進(jìn)行操作時，要求對比兩個實驗室的最終結(jié)果（重復(fù)測定所得數(shù)值的平均值）。通過有機金屬化合物（參考物）的甲基異丙酮（ MIBK），或 MIBK＋ HNO3溶液進(jìn)行校正。該方法的檢出限近似為 （ ），低于 AOCS Ca 1575方法商用油脂的取樣和分析 的檢出限，其數(shù)值近似為 2mg/kg（ 2ppm）。 裝置 1. 原子吸收分光光度計 — 配有 Zecman，或者 SmithHieftje 背景校正器、石墨管狀爐和配套空心陰極燈。 3. 稱量瓶－容量為 10～ 15mL。 5. 烘箱 6. 燒杯－ 25mL 和 100mL。 8. Eppendorf 移液管－ 40 和 50μ L，配有一次性移液頭。 。 （ a） 三價鉻鹽 （ b） 二價銅鹽 （ c） 三價鐵鹽 （ d） 環(huán)己烷丁酸鎳 （ e） 環(huán)己烷丁酸錳 2. 4甲基 2戊酮（甲基異丙酮 MIBK） — 試劑級別（見注解，警告）。 4. 2乙基 己酸 — 實際級別。 6. 硝酸－光譜級別，或者 Ultrex級別（見注解，警告）。稱量 ，倒入容量為 25mL 的燒杯中，加入 5mL的二甲苯和 5mL 的 2乙基己酸，在電熱板上緩慢加熱，不回流，偶爾攪拌，直到樣品溶解。將溶液轉(zhuǎn)入到一個容量為 100mL 的量瓶中，用 5 份 10mL 的 MIBK 溶液沖洗燒杯，洗液倒入量瓶中，稀釋溶液至量瓶滿刻度。 2C 的溫度下，攪拌，保存 。 2. 銅標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液， 100μ g/mL－ 110℃下，將大約 30 分鐘。冷卻至室溫。在 20177。至少 6個月內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液的性質(zhì)保持穩(wěn)定。稱量 的樣品，倒入容量為 25mL 的燒杯中，加入 5mL 的二甲苯和 5mL 的 2乙基己商用油脂的取樣和分析 酸，在電熱板上緩慢加熱，不回流，偶爾攪拌，直到樣品溶解。將溶液轉(zhuǎn)入到一個容量為 100mL 的量瓶中，用 5 份 10mL 的 MIBK 溶液沖洗燒杯，洗液倒入量瓶中，稀釋溶液至量瓶滿刻度。 2C 的溫度下，攪拌，保存。 4. 鎳標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液， 100μ g/mL－用適當(dāng)?shù)男迈r干燥劑，將大約 己烷丁酸鎳干燥 48 小時以上。冷卻至室溫。在 20177。至少6 個月內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液的性質(zhì)保持穩(wěn)定?？焖俜Q量 的樣品，倒入容量為 25mL 的燒杯中，加入 5mL 的二甲苯和 5mL 的 2乙基己酸，在電熱板上緩慢加熱，不回流，偶爾攪拌，直到樣品溶解。將溶液轉(zhuǎn)入到一個容量為 100mL 的量瓶中，用 5 份 10mL 的 MIBK 溶液沖洗燒杯，洗液倒入量瓶中，稀釋溶液至量瓶滿刻度。 2C 的溫度下，攪拌，保存。 操作標(biāo)準(zhǔn) 1. Fe－將 10μ L100ppm 的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液移入一個 25mL 量瓶中。 2. Cu－將 10μ L100ppm 的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液移入一個 25mL 量瓶中。 3. Ni－將 10μ L100ppm 的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液移入一個 25mL 量瓶中。 4. Mn－將 10μ L100ppm 的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液移入一個 25mL 量瓶中。 5. Cr－將 10μ L100ppm 的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備溶液移入一個 25mL 量瓶中。 步驟 1. 準(zhǔn)確稱量 177。 （ a） FeMIBK+25010μ L 濃 HNO3/10mL MIBK （ b） NiMIBK+25010μ L 濃 HNO3/10mL MIBK （ c） CuMIBK （ d） MnMIBK （ e） CrMIBK 2. 遵照下面給出的石墨爐條件搭建實驗裝置： 干燥 30sec 100C 炭化 20sec 800C 霧化 20sec 2300℃ a 氬氣驅(qū)氣 5－ 6L/min a2300℃是裝有帶槽石墨管的 PE HGA2