【正文】 | +H+ | +H+ | R R R 陽(yáng)離子 兩性離子 陰離子 pHpI pH=pI pHpI(pH對(duì)氨基酸離子化的影響示意圖)　　氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算公式：　pH=(pKn+pKn+1)/2 　　　　　　　　n:氨基酸（或多肽）完全質(zhì)子化時(shí)帶正電荷基團(tuán)數(shù)　　　　　　 　pK:解離基團(tuán)的解離常數(shù)等電點(diǎn)的計(jì)算步驟 先將氨基酸/多肽可解離基團(tuán)的pK值自小到大按順序排列 判斷n值 判斷氨基酸的分類(lèi) 酸性氨基酸和中性氨基酸的完全質(zhì)子化數(shù)=1 堿性氨基酸的完全質(zhì)子化數(shù)=2 等電點(diǎn)的應(yīng)用電泳電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為電泳 應(yīng)用氨基酸的分離與分析 氨基酸不同（pI不同，大小不同），在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同，因此可以通過(guò)電泳將氨基酸彼此分開(kāi)此時(shí)蛋白在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，此溶液的pH稱(chēng)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。平行折疊片比反平行折疊片更規(guī)則且一般是大結(jié)構(gòu)而反平行折疊片可以少到僅由兩個(gè)β股組成。α－碳原子位于折疊線上,由于其四面體性質(zhì),連續(xù)的酰氨平面排列成折疊形式。 β－折疊(β－sheet)也是一種重復(fù)性的結(jié)構(gòu),可分為平行式和反平行式兩種類(lèi)型，它們是通過(guò)肽鏈間或肽段間的氫鍵維系。如蛋白質(zhì)的α螺旋、β片層、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲及DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。維持其穩(wěn)定的是次級(jí)鍵,如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力等。四級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條以上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈之間締合在一路的結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈以及側(cè)鏈原子的空間排布。氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指氨基酸主鏈原子的局部空間結(jié)構(gòu),并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈構(gòu)象,二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類(lèi)有α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角兒以及無(wú)規(guī)卷曲。特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)，兩者的關(guān)系可表示為：?Tm=＋*(G+C)%一定條件下(相對(duì)較短的核酸分子)，Tm值大小還與核酸分子的長(zhǎng)度有關(guān)，核酸分子越長(zhǎng)，Tm值越大；另外，溶液的離子強(qiáng)度較低時(shí)，Tm值較低，融點(diǎn)范圍也較寬，反之亦然，因此DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過(guò)低的溶液中。通常將核酸加熱變性過(guò)程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱(chēng)為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類(lèi)似，又稱(chēng)融解溫度(Tm,melting temperature)。若以溫度對(duì)DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型(如下圖)。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時(shí)DNA雙螺旋解開(kāi)，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。變性后整個(gè)DNA分子的對(duì)稱(chēng)性及分子局部的構(gòu)性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后代之以柔軟而松散的無(wú)規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。DNA變性 　　DNA變性指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。這時(shí)，如果除去變性因素，在適當(dāng)條件下變性蛋白質(zhì)可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)復(fù)性（renaturation）。如果變性條件劇烈持久，蛋白質(zhì)的變性是不可逆的。 　　重金屬鹽使蛋白質(zhì)變性，是因?yàn)橹亟饘訇?yáng)離子可以和蛋白質(zhì)中游離的羧基形成不溶性的鹽，在變性過(guò)程中有化學(xué)鍵的斷裂和生成，因此是一個(gè)化學(xué)變化。蛋白質(zhì)的變性很復(fù)雜，要判斷變性是物理變化還是化學(xué)變化，要視具體情況而定。在臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用于消毒及滅菌。 物理變化與化學(xué)變化　　引起蛋白質(zhì)變性的原因可分為物理和化學(xué)因素兩類(lèi)。天然蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是通過(guò)氫鍵等次級(jí)鍵維持的，而變性后次級(jí)鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子就從原來(lái)有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)序的松散的伸展?fàn)罱Y(jié)構(gòu)（但一級(jí)結(jié)構(gòu)并未改變）。 （三）生物化學(xué)性質(zhì)的改變 　　蛋白質(zhì)變性后，分子結(jié)構(gòu)松散，不能形成結(jié)晶，易被蛋白酶水解。有時(shí)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)只有輕微變化即可引起生物活性的喪失。 蛋白質(zhì)變性后的方面（一）生物活性喪失 　　蛋白質(zhì)的生物活性是指蛋白質(zhì)所具有的酶、激素、毒素、抗原與抗體、血紅蛋白的載氧能力等生物學(xué)功能。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有了改變或遭到破壞，都是變性的結(jié)果。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)　　蛋白質(zhì)是由多種氨基酸通過(guò)肽鍵構(gòu)成的高分子化合物，在蛋白質(zhì)分子中各氨基酸通過(guò)肽鍵及二硫鍵結(jié)合成具有一定順序的肽鏈稱(chēng)為一級(jí)結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)的同一多肽鏈中的氨基和酰基之間可以形成氫鍵或肽鏈間形成氫鍵，使得這一多肽鏈具有一定的構(gòu)形，包括α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和自由專(zhuān)曲，這些稱(chēng)為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)連接形成三級(jí)結(jié)構(gòu)；多條肽鏈聚集成為具有一定空間構(gòu)型稱(chēng)為四級(jí)結(jié)構(gòu)，其中一條肽鏈叫一個(gè)亞基。 　　芳香老本色， 　　不搶甘肅來(lái)。 前8種人體必需氨基酸的記憶口訣： 　　?、儋?lài)蛋蘇苯挾一亮色（聯(lián)想記憶法高中生物老師教的，意義深刻） 諧音: 借(纈氨酸), 一(異亮氨酸),兩(亮氨酸),本(苯丙氨酸),蛋(蛋氨酸),色(色氨酸),書(shū)(蘇氨酸),來(lái)(賴(lài)氨酸). 　　20種氨基酸記憶口訣 　　六伴窮光蛋， 酸谷天出門(mén)， 　　死豬肝色臉， 　　只攜一兩錢(qián)。 （arginine）：精氨酸與脫氧膽酸制成的復(fù)合制劑（明諾芬）是主治梅毒、病毒性黃疸等病的有效藥物。凝膠過(guò)濾　　問(wèn)答（有些和名解重復(fù)）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)固定化酶的概念制備方法及優(yōu)點(diǎn)　β氧化與脂肪酸合成的比較乙酰CoA的來(lái)源去路及在細(xì)胞內(nèi)的定位青霉素的抗菌機(jī)制磺胺藥與抗菌增效劑的抗菌機(jī)制現(xiàn)代生物技術(shù)的定義主要內(nèi)容及在新藥研究開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用哪些生化研究成果應(yīng)用于新藥設(shè)計(jì)研究酶催化高效率的因素及基本原理糖在體內(nèi)主要代謝途徑及生理意義糖酵解與糖異生的比較酮體的生成利用及意義尿素循環(huán)過(guò)程，特點(diǎn)及意義大腸桿菌DNA復(fù)制過(guò)程RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程重組DNA技術(shù)概念過(guò)程及應(yīng)用選擇題出題點(diǎn)：20種氨基酸 各自的特點(diǎn)和堿基必需氨基酸　?。╡ssential amino acid）： 指人體（或其它脊椎動(dòng)物）不能合成或合成速度遠(yuǎn)不適應(yīng)機(jī)體的需要，必需由食物蛋白供給，這些氨基酸稱(chēng)為必需氨基酸。離子交換層析親和層析蛋白質(zhì)印跡核酸復(fù)性DNA芯片基因敲除分子病核酸的雜交cDNA文庫(kù)基因文庫(kù)單克隆抗體生物藥物生物技術(shù)藥物基因工程藥物抗代謝物核蛋白體循環(huán)基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄岡崎片斷遺傳中心法則遺傳密碼半保留復(fù)制一碳單位聯(lián)合脫氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用尿素循環(huán)β氧化必需氨基酸必需脂肪酸糖異生作用酮體乳酸循環(huán)TCA循環(huán)粘多糖底物水平磷酸化氧化磷酸化呼吸鏈生物氧化酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶的活性中心必需基團(tuán)同工酶固定化酶 酶活力變構(gòu)效變構(gòu)酶米氏方程米氏常數(shù)蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域堿基互補(bǔ)原則tRNA的三葉草結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)β折疊α螺旋Tm核酸的增/減色效應(yīng)蛋白質(zhì)變性14年生化筆記完全解答（根據(jù)輔導(dǎo)班,歷年真題,藥大內(nèi)部資料整理）選擇題出題點(diǎn)：20種氨基酸 各自的特點(diǎn)和堿基蛋白質(zhì)，核酸變性的特點(diǎn)測(cè)定蛋白質(zhì)含量與分子量的方法原理各類(lèi)連接鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的鍵二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)PI的計(jì)算，氨基酸解離分析分析方法原理：凝膠層析，電泳，離子交換等單抗，多糖，疾病原因酶活力，比活力，Km，(非)競(jìng)爭(zhēng)性抑制 動(dòng)力學(xué)效應(yīng)代謝：限速酶，場(chǎng)所，轉(zhuǎn)運(yùn)，重要聯(lián)系點(diǎn)代謝物抑制劑，呼吸鏈，限速酶過(guò)程：EMP,TCA,尿素循環(huán)，β氧化血漿脂蛋白種類(lèi)作用名詞解釋蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 共有10種其作用分別是： ①賴(lài)氨酸（Lysine ）：促進(jìn)大腦發(fā)育，是肝及膽的組成成分，能促進(jìn)脂肪代謝，調(diào)節(jié)松果腺、乳腺、黃體及卵巢，防止細(xì)胞退化； ②色氨酸（Tryptophan）：促進(jìn)胃液及胰液的產(chǎn)生； ③苯丙氨酸（Phenylalanine）：參與消除腎及膀胱功能的損耗； ④蛋氨酸（又叫甲硫氨酸）（Methionine）；參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進(jìn)脾臟、胰臟及淋巴的功能； ⑤蘇氨酸（Threonine）：有轉(zhuǎn)變某些氨基酸達(dá)到平衡的功能； ⑥異亮氨酸（Isoleucine ）：參與胸腺、脾臟及腦下腺的調(diào)節(jié)以及代謝；腦下腺屬總司令部作用于甲狀腺、性腺； ⑦亮氨酸（Leucine ）：作用平衡異亮氨酸； ⑧纈氨酸（Valine）：作用于黃體、乳腺及卵巢。 人體雖能夠合成Arg和His，但合成的量通常不能滿足正常的需要，因此，這兩種氨基酸又被稱(chēng)為半必需氨基酸。 　　一本落色書(shū)， 　　揀來(lái)精讀之。 　　六伴窮光蛋：硫、半、光、蛋→半胱、光、蛋（甲硫）氨酸→含硫氨基酸 　　酸谷天出門(mén)：酸、谷、天→谷氨酸、天門(mén)冬氨酸→酸性氨基酸 　　死豬肝色臉：絲、組、甘、色→絲、組、甘、色氨酸→一碳單位來(lái)源的氨基酸 　　只攜一兩錢(qián)：支、纈、異亮、亮→纈、異亮、亮氨酸→支鏈氨基酸 　　一本落色書(shū)：異、苯、酪、色、蘇→異亮、苯丙、酪、色、蘇氨酸→生糖兼生酮 　　揀來(lái)精讀之：堿、賴(lài)、精、組→賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸→堿性氨基酸 　　芳香老本色：芳香、酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸 　　不搶甘肅來(lái)：脯、羥、甘、蘇、賴(lài)→脯、羥脯、甘、蘇、賴(lài)氨酸→不參與轉(zhuǎn)氨基的氨基酸蛋白質(zhì)，核酸變性的特點(diǎn)蛋白質(zhì)變性（protein denaturation）是指蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下其特定的空間構(gòu)象被改變，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)變性的原因　　變性作用是蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，改變其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的作用。能使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)方法有加強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白質(zhì)變性的物理方法有加熱(高溫)、紫外線及X射線照射、超聲波、劇烈振蕩或攪拌等。生物活性喪失是蛋白質(zhì)變性的主要特征。 （二）某些理化性質(zhì)的改變 　　蛋白質(zhì)變性后理化性質(zhì)發(fā)生改變，如溶解度降低而產(chǎn)生沉淀，因?yàn)橛行┰瓉?lái)在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)由于結(jié)構(gòu)松散而暴露出來(lái),分子的不對(duì)稱(chēng)性增加，因此粘度增加，擴(kuò)散系數(shù)降低。蛋白質(zhì)的變性作用主要是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)被破壞。所以，原來(lái)處于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)大量暴露在分子表面，而親水基團(tuán)在表面的分布則相對(duì)減少，至使蛋白質(zhì)顆粒不能與水相溶而失去水膜，很容易引起分子間相互碰撞而聚集沉淀。物理因素可以是加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波的作用等；化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。反之，注意防止蛋白質(zhì)變性就能有效地保存蛋白質(zhì)制劑。如果有化學(xué)鍵的斷裂和生成就是化學(xué)變化；如果沒(méi)有化學(xué)鍵的斷裂和生成就是物理變化。 蛋白質(zhì)復(fù)性　　蛋白質(zhì)在受到光照、熱、有機(jī)溶劑以及一些變性劑的作用時(shí)，次級(jí)鍵受到破壞，導(dǎo)致天然構(gòu)象的破壞，使蛋白質(zhì)的生物活性喪失。如果變性條件不劇烈，這種變性作用是可逆的，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化不大。例如胃蛋白酶加熱至80～90℃時(shí)，失去溶解性，也無(wú)消化蛋白質(zhì)的能力，如將溫度再降低到37℃，則又可恢復(fù)溶解性和消化蛋白質(zhì)的能力。變性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 　　變性DNA常發(fā)生一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變： 1）溶液粘度降低。2）溶液旋光性發(fā)生改變。 3）增色效應(yīng)(hyperchromic effect)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長(zhǎng)紫外光的特性。 融解溫度　　對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時(shí)，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。可見(jiàn)DNA變性是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。在Tm時(shí)，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。測(cè)定蛋白質(zhì)含量與分子量的方法原理各類(lèi)連接鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的鍵多肽鏈中氨基酸殘基的構(gòu)成以及排列順序稱(chēng)為氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),連接一級(jí)結(jié)構(gòu)的鍵是肽鍵。氫鍵是維系二級(jí)結(jié)構(gòu)最主要的鍵。次級(jí)鍵維持其穩(wěn)定, 最主要的鍵是疏水鍵。其中每條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱(chēng)為亞基,一般具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸才有生物科學(xué)活性。 二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈或多核苷酸鏈沿分子的一條軸所形成的旋轉(zhuǎn)和折疊等，主要是由分子內(nèi)的氫鍵維系的局部空間排列。β轉(zhuǎn)角：蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型之一,由4個(gè)氨基酸殘基組成，其中第一個(gè)殘基的CO基團(tuán)和第四個(gè)殘基的NH基團(tuán)之間形成氫鍵，使多肽鏈的方向發(fā)生“U”形改變?？梢园阉鼈兿胂鬄橛烧郫B的條狀紙片側(cè)向并排而成,每條紙片可看成是一條肽鏈, 稱(chēng)為β折疊股或β股(β－strand),肽主鏈沿紙條形成鋸齒狀,處于最伸展的構(gòu)象,氫鍵主要在股間而不是股內(nèi)。需要注意的是在折疊片上的側(cè)鏈都垂直于折疊片的平面,并交替的從平面上下二側(cè)伸出。PI的計(jì)算，氨基酸解離分析等電點(diǎn)（pI,isoelectric point） 　　蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在特定的pH溶液中所帶正電荷數(shù)恰好等于負(fù)電荷數(shù)。 　　因?yàn)楫?dāng)環(huán)境PH值等于PI值時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，常用于分離和提純蛋白質(zhì)或氨基酸。 當(dāng)pH=pI時(shí)，氨基酸呈兼性離子，在電場(chǎng)中不移動(dòng) 當(dāng)pHpI時(shí)，氨基酸帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)　 根據(jù)支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。凝膠電泳通常用于分析用途，但也可以作為制備技術(shù)，在采用某些方法（如質(zhì)譜(MS)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、克隆技術(shù)、DNA測(cè)序或者免疫印跡）檢測(cè)之前部分提純分子。它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子的凝膠物。當(dāng)樣品通過(guò)凝膠進(jìn)行電泳時(shí)，便可以根據(jù)其樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動(dòng)出不同的區(qū)帶。等電點(diǎn)聚焦（IEF）是在電場(chǎng)中分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展，等