【正文】 周散發(fā)的，介質(zhì)中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質(zhì)相對于外周部分粘度下降，摩擦系數(shù)減小，電泳遷移速度增大，電泳分離帶通常呈弓型。電流在介質(zhì)中所做的功（ W）為： W=I2Rt ?I為電流強度， R為電阻， t為電泳時間。電場強度越大，電泳速度越快。粘度過大或過小，必然影響泳動度。 ?離子強度的計算公式為： I＝ 1/2∑mizi2=1/2(m1z12+m2z22+…m nzn2) ?I：溶液的離子強度； mi：離子的摩爾濃度； zi：離子的價數(shù)； 1， 2， …n 代表各種離子。 ?離子強度過低，則緩沖能力差，往往會因溶液 pH值變化而影響泳動的速率。 ?電泳時應(yīng)選擇適宜的 pH值，并需采用緩沖溶液，使溶液的 pH值恒定。 ?對兩性電解質(zhì)（如蛋白質(zhì)）而言，溶液的 pH值離其等電點越遠(yuǎn)，帶凈電荷量就越多，泳動速度就越快。 緩沖液的性質(zhì) ?主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的 pH值、離子強度和粘度等。 第三節(jié) 影晌電泳分離的主要因素 待分離生物大分子的性質(zhì) 緩沖液的性質(zhì) 電場強度 電滲 支持介質(zhì)的篩孔 待分離生物大分子的性質(zhì) ?待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會對電泳有明顯影響。 ?即使兩個分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。 ?當(dāng)帶電分子勻速移動時： F = F’ ∴ qE = 6πrηυ υ=qE/6πrη ?電泳遷移率（ m）：單位電場強度下的遷移速度： m = υ/E = q/6πrη ?電泳遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。即： F＝ qE ?帶電分子移動過程中，會受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。 ?垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。 ?電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動帶電分子的遷移。 ?支持介質(zhì)：濾紙、醋酸纖維素膜、硅膠薄層平板、淀粉凝膠、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等。 ?Tiselius等在 1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對流都比較強，影響分離效果。 ?電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 第二節(jié) 電泳的基本原理 ?電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個點）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“ Last Check”。 ?上世紀(jì) 50年代起，特別是 1950年， Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。 ?1937年，瑞典 Uppsala大學(xué)的 Tiselius對電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了 Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及 α、 β、 γ球蛋白組成的，由于 Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻(xiàn)而獲得了 1948年的諾貝爾化學(xué)獎。 ?1909年， Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。第八章 電泳技術(shù) 第八章 電泳技術(shù) 第一節(jié) 電泳技術(shù)發(fā)展簡史 第二節(jié) 電泳的基本原理 第三節(jié) 影晌電泳分離的主要因素 第四節(jié) 電泳的分類 第五節(jié) 各種電泳技術(shù)介紹 第六節(jié) 電泳測純技術(shù) 第一節(jié) 電泳技術(shù)發(fā)展簡史 ?1809年，俄國物理學(xué)家 Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。他用不同 pH的溶液在 U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。 ?1948年， Wieland和 Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進(jìn)行了研究。 ?1959年， Raymond和 Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。 ?上個世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。 ?許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個特定的 pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。 ?電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。 ?樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程，減少了擴(kuò)散和對流等干擾作用。 ?電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。 ?電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。 ?稀溶液中，電場對帶電分子的作用力（ F）等于分子所帶凈電荷量（ q）與電場強度（ E）的乘積。粘滯力（ Fˊ）的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動速度成正比，對于球狀分子， Fˊ的大小服從 Stoke定律，即：Fˊ=6πrηυ ?r是球狀分子的半徑， η是緩沖液粘度（或介質(zhì)粘滯系數(shù)）， υ是電泳速度 (單位： cm/s )。 ?帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。 ?有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳； ?有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ?一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 pH值 ?溶液 pH值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電荷的量。 ?緩沖液 pH還會影響到其電泳方向，當(dāng)緩沖液 pH大于兩性電解質(zhì)的等電點，兩性電解質(zhì)帶負(fù)電荷，其電泳的方向是指向正極。 離子強度 ?為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液 pH值的穩(wěn)定性，緩沖液通常要保持一定的離子強度，一般在 － 。 ?離子強度過高，會在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），由于離子氛與待分離分子的移動方向相反，它們之間產(chǎn)生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。 溶液粘度 ?泳動度與溶液粘度是成反比關(guān)系。 電場強度 ?電場強度（ V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。但增大電場強度會引起通過介質(zhì)的電流強度增大，而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增大。 ?電流所作的功絕大部分都轉(zhuǎn)換為熱，因而引起介質(zhì)溫度升高，這會造成很多影響： ①樣品和緩沖離子擴(kuò)散速度增加，引起樣品分離帶的加寬； ②產(chǎn)生對流，引起待分離物的混合； ③如果樣品對熱敏感，會引起蛋白變性； ④引起介質(zhì)粘度降低、電阻下降等等。 ?電場強度或電極緩沖液中離子強度增高時，電流強度會隨著增大。 ?電流強度過低，生熱少，電泳時間延長，引起待分離生物大分子擴(kuò)散的增加而影響分離效果。 電滲 ? 當(dāng)支持物不是絕對惰性物質(zhì)時，常常會有一些離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對帶電。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會向正極移動。 ?電泳電場中，液體也會相對固體支持介質(zhì)發(fā)生移動，出現(xiàn)電滲現(xiàn)象。 ?當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向一致時，則加快顆粒的泳動速度；當(dāng)顆粒的泳動方向與電滲方向相反時，則降低顆粒的泳動速度。 ?在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快，反之，則泳動速度慢。 第四節(jié) 電泳的分類 電泳按其分離的原理分類 按支持介質(zhì)的分類 按支持介質(zhì)形狀分類 按用途分類 按所用電壓分類 電泳按其分離的原理分類 ⑴ 區(qū)帶電泳：電泳過程中，待分離的各組分在支持介質(zhì)中被分離成許多條明顯的區(qū)帶，應(yīng)用最廣。 ⑶ 等速電泳：需使用專用電泳儀，電泳平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰界面，以等速向前運動。 按支持介質(zhì)分類 ⑴ 紙電泳（ Paper electrophorisis） ⑵ 醋酸纖維薄膜電泳 （ Cellulose Acetate electrophoresis） ⑶ 瓊脂凝膠電泳（ Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ Polyacrylamide Gel electrophoresis， PAGE） ⑸ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）。 按用途分類 ⑴ 分析電泳； ⑵ 制備電泳； ⑶ 定量免疫電泳； ⑷ 連續(xù)制備電泳。 ⑵ 高壓電泳： 1000V～ 5000V，電泳時間短，有時只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離。也就是把樣品以帶狀加在作為支持體的濾紙內(nèi)來檢測其移動和分離的方法。 ?分辨率比凝膠介質(zhì)要差，但操作簡單，所以仍有很多應(yīng)用，特別是在血清樣品的臨床檢測和病毒分析等方面有重要用途。 ?定量測定的方法有洗脫法和光密度法。 ?光密度法是將染色后的干濾紙用光密度計直接定量測定各樣品電泳區(qū)帶的含量。將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨ィ苡诒笸坎汲傻木患?xì)密微孔的薄膜。 正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖 1：清蛋白； 2： α1球蛋白； 3： α2球蛋白； 4： β球蛋白； 5： γ球蛋白； 6：點樣原點 ?醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相比的優(yōu)點： ① 對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無“拖尾”現(xiàn)象。親水性小，吸水少，電滲作用小。臨床醫(yī)學(xué)用于檢測微量異常蛋白的改變。可用于那些紙電泳不易分離的樣品，如胎兒甲