【正文】 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） 35 ? 考馬斯亮染色 ? 銀鹽染色 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） 36 瓊脂糖凝膠電泳 （ Agarose gel electrophoresis） 瓊脂糖 Agarose，縮寫(xiě)為 AG，是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份，也譯為瓊膠素或瓊膠糖。 影影 響響 因因 素素 ：： 11 、 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺 凝凝 膠膠 孔孔 徑徑 的的 大大 小小 22 、 緩緩 沖沖 系系 統(tǒng)統(tǒng) 33 、 離離 子子 強(qiáng)強(qiáng) 度度 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） 34 PAGE（ polyacrylamide gel electrophoresis ）即聚丙稀酰胺是由丙烯酰胺和 N,N’亞甲基雙丙烯酰胺共聚合而成。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） 33 不不 連連 續(xù)續(xù) 凝凝 膠膠 電電 泳泳 的的 分分 離離 原原 理理 ：： 11 、 樣樣 品品 的的 濃濃 縮縮 效效 應(yīng)應(yīng) 11 ）） 凝凝 膠膠 層層 的的 不不 連連 續(xù)續(xù) 性性 22 ）） 緩緩 沖沖 液液 離離 子子 成成 分分 的的 不不 連連 續(xù)續(xù) 性性 22 、 電電 荷荷 效效 應(yīng)應(yīng) 各各 種種 蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì) 所所 帶帶 電電 荷荷 不不 同同 ， 有有 效效 遷遷 移移 率率 也也 不不 同同 33 、 分分 子子 篩篩 效效 應(yīng)應(yīng) 凝凝 膠膠 濃濃 度度 不不 同同 ， 網(wǎng)網(wǎng) 孔孔 徑徑 大大 小小 不不 同同 。 濃縮膠 （ pH6. 8， 孔徑大 ）主要作用是使樣品濃縮，使樣品在未進(jìn)入分離膠前，被濃縮成很窄的條帶，從而提高分離效果。解聚后的蛋白質(zhì)分子與 SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物，復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過(guò) 了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。 31 基本原理 SDS 即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵 。 最常用 聚丙烯酰胺凝膠 和 瓊脂糖凝膠電泳 原因： 機(jī)械強(qiáng)度好，透明有彈性，穩(wěn)定，無(wú)吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等，具有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高。最初用于蛋白質(zhì)，后來(lái)也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)在于或采用濾紙與色素結(jié)合的直接電泳圖，或剪下濾紙的任何部分來(lái)抽提其中的物質(zhì)。 濾紙水平地架設(shè)在支持板上。 6. 溫度 電泳時(shí)電流通過(guò)支持介質(zhì)會(huì)產(chǎn)生熱量。 24 +++++++++ ————— ————— +++++++++（ 液 ） 負(fù)極 ← →正極 4. 電滲效應(yīng) 電滲 （ electroosmosis） ——指在電場(chǎng)作用下液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。1) (pK180。 I↑→緩沖能力越大 →緩沖液所載的分電流增加 ， 而樣品所載的電流相應(yīng)減少 →電泳速度減慢 2. 離子強(qiáng)度 （ I） ?? 221iiZmI（ m： 離子的摩爾濃度， Z：離子的價(jià)數(shù)） 對(duì)于稀溶液： 22 pH值決定了化合物解離的程度 ， 也決定了物質(zhì)所帶的凈電荷 。 18 ? 以蛋白質(zhì)分子為例 : （ q： 有效電荷， E： 場(chǎng)強(qiáng)） F= Eq 電場(chǎng)力： F’=6?r?v （ F’： 摩擦阻力， v： 在介質(zhì)粘度 η中半徑為 r的顆粒的移動(dòng)速度） 阻力： 19 V q M = ——— = ———— E 6?r? E q v = ———— 6?r? Eq = 6?r?v F = F’ 遷移率 （ Mobility) ——帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。移動(dòng)的帶電粒子受到電場(chǎng)力和周?chē)橘|(zhì)阻力的作用，當(dāng)二力平衡時(shí)，粒子以穩(wěn)定的速度向電極方向移動(dòng)。 17 六、電泳的基本原理 懸浮或溶解在電解質(zhì)溶液中的帶電粒子，在電場(chǎng)作用下以不同的速度向著與自身所帶電荷極性相反的電極移動(dòng)。 ? 分辨率高 . 16 五、電泳技術(shù)應(yīng)用 ?臨床診斷 進(jìn)行血清蛋白、血紅蛋白、精蛋白、脂蛋白的分離、鑒定和含量測(cè)定以及血清學(xué)酶的檢驗(yàn)、免疫化學(xué)檢驗(yàn)等。 ? 可在常溫進(jìn)行 。 ? 樣品用量極少 。 優(yōu)點(diǎn)： 在不同 pH區(qū)之間形成高的電位梯度區(qū) ，使蛋白質(zhì)移動(dòng)加速壓縮為一極狹的區(qū)帶而達(dá)到濃縮的目的 。 區(qū)帶電泳 — 使用支持物 (1) 按 支持物的物理性狀不同 ，可分為 7 (2) 按 支持物的裝置形式不同 ， 可分為 ① 平板式電泳 ② 垂直板式電泳 ③ 垂直柱式電泳 8 9 10 11 12 13 14 連續(xù) pH電泳 —指電泳過(guò)程中 pH保持不變 ， 如濾紙電泳 、 醋纖膜電泳 。 利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。 第五章 電泳技術(shù) Electrophoresis 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 劉蕓 1 內(nèi)容提綱 ? 紙電泳 ? 凝膠電泳 ? 等電聚焦電泳 ? 熒光差異雙向電泳技術(shù)（ DIGE） ? 毛細(xì)管電泳技術(shù) 電泳技術(shù)概論 3 13 2 常用電泳技術(shù) 2 一、定義 電泳： 帶電粒子在直流電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)： 生物樣品在電泳過(guò)程中因各組分的移動(dòng)快慢不同而被分離的技術(shù) 。 第一節(jié) 電泳技術(shù)概論 3 4 二、電泳分析技術(shù)發(fā)展概況 1809年 發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象 1937年 Tiselius 自由界面電泳 1948年 Wieland 濾紙電泳 1959年 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1980’ s 毛細(xì)管電泳 (capiliary electrophoresis) Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 蒂塞利烏斯(瑞典人 )因研究電泳和吸附分析，特別是發(fā)現(xiàn)關(guān)于血清蛋白的復(fù)雜本質(zhì)而獲獎(jiǎng) 1948 5 三、電泳分析技術(shù)的分類(lèi) 1. 根據(jù)被分離樣品的量多少 分析電泳 制備電泳 2. 根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳 100～ 500 V 高壓電泳 500～ 10kV 6 ① 濾紙及其他纖維薄膜電泳 ， 如醋酸纖維素 、 玻璃纖維 、 聚氯乙烯纖維 ② 凝膠電泳 ， 如瓊脂 、 瓊脂糖 、 硅膠 、 淀粉膠 、 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ③ 粉末電泳 ， 如纖維素粉 、 淀粉 、 玻璃粉電泳 ④ 絲狀電泳 ， 如尼龍絲 、 人造絲電泳 3. 根據(jù)電泳中是否使用支持物 自由電泳 — 不使用支持物，在溶液中進(jìn)行。 不連續(xù) pH電泳 —指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段有不同的 pH， 如 PAGE、 IFE。 4. 根據(jù)電泳系統(tǒng) pH是否連續(xù) ， 可分為 15 四、電泳技術(shù)的特點(diǎn) ? 凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分 離 ,并可進(jìn)行定性或定量分析 。 ? 設(shè)備簡(jiǎn)單 。 ? 操作簡(jiǎn)便省時(shí) 。 ?工業(yè)制造 用于提純酶、激素及其它生化產(chǎn)品 ?基礎(chǔ)理論研究 從分離與分析無(wú)機(jī)離子到復(fù)雜的生物高分子化合物，以及在放射化學(xué)和免疫化學(xué)中都占有重要的地位；在各類(lèi)電泳技術(shù)中，尤以凝膠電泳在分離分析酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子等方面分辨力為最高，為生物化學(xué)，分子生物學(xué)的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)。在電泳過(guò)程中，帶正電荷的粒子向電場(chǎng)的負(fù)極方向移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向電場(chǎng)的正極方向移動(dòng)。 由于電荷、質(zhì)量等的差異，粒子將會(huì)有不同的質(zhì)/荷比，使其在電場(chǎng)中具有不同的遷移速度。 20 七、影響電泳速度的因素 1. 電場(chǎng)強(qiáng)度 （ E） E↑→電流 ↑→熱效應(yīng) →支持介質(zhì)上的水分蒸發(fā) →樣品的熱變性 E↓→電泳速度慢 →延長(zhǎng)電泳時(shí)間 →樣品擴(kuò)散 →區(qū)帶模糊不清 →分辨率下降 常壓電泳 100～ 500 V 1V/cm~10V/cm 高壓電泳 500～ 10kV 20V/cm~200V/cm 21 溶液的 I 越高 ， 質(zhì)點(diǎn)的泳動(dòng)速度越慢 ， 但區(qū)帶分離度卻較清晰 。 3. 緩沖液的 pH 23 氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)（ pI） pH = pI 凈電荷 =0 pH pI 凈電荷為正 pH pI 凈電荷為負(fù) NH2 CH R COOH NH3+ CH R COO CH R COO NH3+ + H+ + OH + H+ + OH (pK180。2) 等電點(diǎn) (isoelctric point)： 當(dāng)氨基酸溶液在某一定 pH值時(shí) ， 使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等 ， 成為兩性離子 ， 在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng) ， 此時(shí)溶液的 pH值 。 25 5. 分子篩 在凝膠電泳中 ， 分離蛋白質(zhì)等物質(zhì)除了利用所帶電荷的差異的效應(yīng)外 ， 還利用了其分子量的不同及形狀不同 。 按焦耳定律，電流通過(guò)導(dǎo)體時(shí)的產(chǎn)熱與電流強(qiáng)度的平方