【正文】 In this paper, the tinder fungus enzymology properties of laccase were studied. Results are as follows: to ABTS as substrate, the enzyme reaction of the optimum temperature is 50 ℃ 。 10mM/L 的 Ba2+、 Ca2+、 Co+、 Fe3+、 Na+、 K+這六個金屬離子對漆酶酶活有較強(qiáng)的抑制作用，其中 Fe3+的抑制作用最強(qiáng)，而 Mg2+， Cu2+對兩種漆酶均有激活作用。C 以下保持酶活力相對穩(wěn)定， 50176。I 木蹄層孔菌 Lac 的酶學(xué)性質(zhì)研究 摘 要 本文對木蹄層孔菌漆酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果如下：以 ABTS 作為底物，酶反應(yīng)的最適溫度為 50℃ ；最適 pH 值為 3；在 40176。C 酶活性基本全部喪失 ；在pH 值 ~4 范圍內(nèi)保持相對較高的酶活力。 以 ABTS 為底物時，漆酶的 Km 值為 。 The optimal pH value is 3。 C, basic all lose enzyme activity under 50 176。 Within the scope of the pH value of ~ 4 remained relatively high enzyme activity. 10 mm/L Co+, Ca2+, Ba2+, Fe3+, Na+, K+ the six metal ions on laccase enzyme activity had a stronger inhibitory effect, one of the strongest inhibitory effect of Fe3+, and Mg 2+, Cu2+ effect on two kinds of laccase are activated. ABTS as substrates, laccase Km value tendency for L. Key words: tinder fungus， laccase， enzymatic properties III 目 錄 第 1章 緒論 ....................................................................... 1 ..................................................... 1 ........................................................... 1 ............................................................. 2 ............................................................... 3 第 2 章 材料和方法 ................................................................. 4 ............................................................... 4 .................................................................... 4 、試劑 ........................................................... 4 ................................................................. 5 ..................................................................... 5 ......................................................... 5 ............................................................. 5 ............................................................. 6 ........................................................... 7 第 3章 結(jié)果與分析 ................................................................. 8 pH值及 pH穩(wěn)定性 ..................................................... 8 ........................................................... 9 ............................................ 10 .......................................................................... 10 第 4章 討論 ...................................................................... 12 致 謝 ............................................................................ 13 參考文獻(xiàn) ......................................................................... 14 第 1 頁 共 14 頁 第 1 章 緒論 木蹄層孔菌國內(nèi)外研究進(jìn)展 木蹄層孔菌 (Fomes fomentarius(L.:Fr.)Kick.)是一種多孔菌科的高等藥用真菌，是世界性分布的木腐性真菌 [1]。單一顆樹上就可以有多個 子實(shí)體 。子實(shí) 體大至巨大，馬蹄形，無柄。菌管多層，軟木栓質(zhì)，多年生，生于櫟、樺、楊、柳、椴、榆、 水曲柳 、梨、李、蘋果等闊葉樹干上或木樁上。 往往在生境陰濕或較黑暗的生境出現(xiàn)棒狀畸形子實(shí)體。 在 18 世紀(jì)和 19世紀(jì)，木蹄層孔菌曾被用來作為止血的膏藥，在一些傳統(tǒng)的藥典中被用來作為針灸的工具 [5]。國內(nèi)外對木蹄的研究結(jié)果表明，木蹄具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗氧化等功效。 有學(xué)者對木蹄層孔菌子實(shí)體化學(xué)成分做研究表明其含有酚、有機(jī)酸、苷類等 [8]。 漆酶國內(nèi)外研究進(jìn)展 漆酶即多酚氧化酶，是一種藍(lán)色多銅氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作為氧化劑，氧化木質(zhì)素中酚型單元成為酚氧游離基，同時還原分子氧生成水。漆酶按來源可分為漆樹漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶，其中 以真菌漆酶為主。白腐真菌漆酶通常以多重基因編碼的同工酶形式出現(xiàn)，有來源廣泛、單第 2 頁 共 14 頁 電子氧化還原電位高、可以催化降解多環(huán)芳烴類物質(zhì)等特點(diǎn) [10]。目前漆酶的研究主要集中于對漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，酶活測定，發(fā)酵條件研究這方面，已有利用漆酶降解木材中的木質(zhì)素、生產(chǎn)酒精和利用漆酶區(qū)分嗎啡和可卡因的先例 [11]。 漆酶催化苯酚類芳香胺等物質(zhì) 的 整個催化過程大致包括 ： 酶分子對底物的作用 、 電子在酶分子中的傳遞 、 氧分子對酶分子的還原 。 在氧的存在下，還原態(tài)漆酶被氧化，氧分子被還原為水。在這一過程中，漆酶從被氧化的底物分子中提取一個電子，使之形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，可進(jìn)一步發(fā)生聚合或解聚反應(yīng)。另一方面，漆酶催化底物氧化和對 O2的還原是通過四個銅離子協(xié)同傳遞電子和價(jià)態(tài)變化來實(shí)現(xiàn)的。還原性底物結(jié)合于 T1cu 位點(diǎn)， T1Cu 從中提取1 個電子，該電子通過 CysHis 途徑傳遞到 T2/T3Cu三核中心位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合了第二底物分子氧，接受 T1Cu 的電子，并傳遞給氧，使之還原為水 [12]。 這一類底物最容易被氧化 ； 芳胺及其衍生物： 如鄰聯(lián)茴香胺。 第 3 頁 共 14 頁 漆酶的應(yīng)用 漆酶作為一種高效，綠色的催化劑，隨著固定化技術(shù)的不斷發(fā)展，擴(kuò)大了漆酶的工業(yè)應(yīng)用范圍和前景，固定化酶在廢水處理，生物傳感器，食品行業(yè)方面中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。 這是漆酶最有前景的應(yīng)用 [13]。漆酶來源廣泛、使用方便 ，降解木質(zhì)素效率高， 固定化后能更有效的發(fā)揮作用 。 在飲料方面的應(yīng)用： 除去 啤酒和果汁等飲料 原料中的酚，提高啤酒質(zhì)量和透明度 。 在食用菌和藥用菌方面的應(yīng)用： 在食用菌制種過程中加入漆酶制劑能加速木質(zhì)素的分解，能為菌絲提供更豐富的養(yǎng)料，加快菌絲 吃 料，縮短培養(yǎng)時間。 去除氯酚類有機(jī)化合物 ： 很多研究表明，漆酶具有轉(zhuǎn)化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚等。 染料降解 ： 在印染和造紙等工業(yè)過程中，大量含有染料的廢水釋放，成為當(dāng)今主要的環(huán)境問題之一。 漆酶在催化過程中消耗氧氣，這一過程 很容易被轉(zhuǎn)化為電信號而高靈敏地得到檢測。同時由于漆酶能夠催化多種酚類物質(zhì)生成酚類化合物，固定化漆酶電極作為生物傳感器在酚類物質(zhì)的檢測中應(yīng)用廣泛 [15]。 實(shí)驗(yàn)方法 木蹄層 孔菌的培養(yǎng) PDA培養(yǎng)基 在燒杯中加入 300ml 蒸餾水，將土豆去皮切成 5mm 的小方塊。 活化菌種 在微波爐中溶解土豆培養(yǎng)基，移入超凈工作臺，將培養(yǎng)基分裝在滅菌的培養(yǎng)皿中，等其形成固體后，再分別接上菌種。 配制液體培養(yǎng)基，接菌培養(yǎng) 配制液體培養(yǎng)基（表 22），將配制好的液體培養(yǎng)基平均分配到 100ml三角瓶中，每瓶中加入 15ml培養(yǎng)基。 粗酶液的制備 第 6 頁 共 14 頁 取培養(yǎng) 10天的培養(yǎng)物 ，分別加入 3 個 ， 20176。 漆酶酶 學(xué)性質(zhì) 在大離心管中依次加入 100mM 的酒石酸鈉 （ ） 300μ L， 1mM 的 ，蒸餾水 700μ L，酶液預(yù)熱后取 500μ L 加入到離心管中混勻，轉(zhuǎn)移到比色皿中在 420n