【正文】 ............................................................10 病原菌的個體形態(tài)特征 .....................................................................................................11 16S RDNA 序列分析 ...........................................................................................................13 菌株 S1 的 16S rDNA 序列分析 ..................................................................................13 菌株 S2 的 16S rDNA 序列分析 ..................................................................................14 病原菌的生理生化性狀 .....................................................................................................17 菌株 S1 的生理生化特征 .............................................................................................17 菌株 S2 的生理生化特征 .............................................................................................18 抑菌劑的篩選 .....................................................................................................................20參考文獻 ........................................................20致謝 ............................................................21食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究11．引言 課題研究背景杏鮑菇 Pleurotus eryngii 日名“雪茸”隸屬于傘菌目(AgaricaIes) ，側(cè)耳科 (Pleurotaceae)，側(cè)耳屬(Pleurotus)。近年在杏鮑菇工廠化生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的污染菌，有些菇農(nóng)種植的杏鮑菇其污染率超過了 50％以上，杏鮑菇生產(chǎn)因污染菌造成的損失達億元以上。多年來, 我們研究對造成杏鮑菇病害的細菌對指導(dǎo)食用菌生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實意義, 對提高杏鮑菇栽培的產(chǎn)量、質(zhì)量和效益發(fā)揮了很大作用。后來美國、法國、丹麥、英國、德國、荷蘭、澳大利亞等國相繼報道，并推廣用漂白粉水溶液進行防治。此后,有關(guān)細菌性斑點病的研究向深度和廣度展開。比利時學(xué)者 M．GOOT 等人應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對分離到的 20 多個菌株進行了比較鑒定后分成 7 個類型。食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究2 常見細菌病害 [3] 細菌性斑點病, 又叫細菌性褐斑病,主要危害蘑菇和平菇。濕度大時, 凹斑內(nèi)有粘稠的菌液, 當(dāng)病斑干后,菌蓋往往開裂。 細菌性軟腐病主要危害平菇、金針菇、杏鮑菇 [4], 極為嚴(yán)重。病原據(jù)鑒定, 細菌性軟腐病是由一種螢光假單胞桿菌引起。癥狀染病菇畸形、褐色, 典型特征是菌蓋歪斜, 菇柄基部稍膨大, 但不腐爛, 逐漸萎縮、干枯, 發(fā)病嚴(yán)重時 , 菌柄全部變褐色。病原該病由一種假單孢桿菌引起。發(fā)病癥狀發(fā)病的菇體先在菌蓋表面產(chǎn)生褐色斑塊, 隨著菇體的生長, 褐斑逐漸擴大, 深入菌蓋, 直至整個子實體全部變褐至黑褐, 而萎縮死亡, 最后腐爛。 課題主要研究內(nèi)容從杏鮑菇生產(chǎn)廠（昆山正興食用菌有限公司）中污染的生產(chǎn)包分離純化，得到純菌落；查閱資料，做相關(guān)的生理生化實驗；提取相關(guān)基因，測序，比對，鑒定實驗菌的種類；查閱相關(guān)資料，考察不同的抗生素對實驗菌的藥性，找出對該實驗菌的防治措施。培養(yǎng) 24h 后，挑去出現(xiàn)的單菌落，采用平板劃線分離法，進行病原菌的分離純化，純化培養(yǎng)菌株 2 個，分別記為：SS2。 病原菌的形態(tài)觀察及染色將病原菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 30℃培養(yǎng) 24 h 后，觀察牛肉膏蛋白胨平板菌落形態(tài)、牛肉膏蛋白胨斜面菌苔形態(tài)、肉汁凍液體培養(yǎng)基中的生長情況。 病原菌的生理生化性狀參照文獻[5,7,8,9] 葡萄糖氧化發(fā)酵作用的測定本試驗采用休和利夫森二氏培養(yǎng)基，其配方如下：蛋白胨 2g，NaCl 5g，K 2HPO4 ，葡萄糖 10g，蒸餾水 1000ml， 1％溴麝香草酚藍水溶液 3ml， 用接種環(huán)挑取少量菌種于試管中培養(yǎng) 2448h。食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究4 氧化酶直接在菌苔上滴加鹽酸二甲基對苯二胺(或鹽酸對氨基二甲基苯胺)1％水溶液，不可過濕。 色素的產(chǎn)生修改金氏(King) 等培養(yǎng)基配方如下：金氏等 A 培養(yǎng)基金氏等 B 培養(yǎng)基蛋白胨 2g 2gK2SO4 1g ―甘油 1g 1gMgCl2 ―K2HPO4 ― MgSO4?7H20 ― 瓊脂 2g 2g蒸餾水 100ml 100ml調(diào) PH 為 ，用新鮮菌種按種上述兩種培養(yǎng)基上，于 2830℃培養(yǎng)14d 觀察。 接觸酶將測定菌按種于適宜的斜面上，適溫培養(yǎng) 1824h 取一環(huán)培養(yǎng) 1824h 的菌苗涂于于凈的載破片上，然后滴上一滴 310％的過氧化氫，若有氣泡(氧氣)，則為接觸酶陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。腸桿菌科的菌要求在 37℃培養(yǎng) 4d 檢查。 乙酰甲基甲醇試驗（）培養(yǎng)基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，K 2HPO4 5g，水 1000ml， ，每管分裝 45ml接種試驗菌于以上培養(yǎng)液中，每次 2 個重復(fù)，置適溫培養(yǎng) 2d．6d?？蓪⑴囵B(yǎng)液置 4850℃水浴中處理 2h 充分搖動，在4h 內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽性反應(yīng)。培養(yǎng) 7d 的培養(yǎng)液，沿管壁緩緩加入 毫升的乙醚至培養(yǎng)液，充分震蕩，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚試劑。濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)，乙醚層出現(xiàn)玫瑰紅色，此反應(yīng)為陽性，反之為陰性。產(chǎn)黑褐色色素者為陽性，不產(chǎn)黑褐色素者為陰性。于 20℃溫箱中培養(yǎng)，食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究614 和 30d 在 20℃以下的室溫觀察茵的生長情況和明膠是否液化。如明膠凝塊部分或全部在 20℃以下變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為明膠水解陽性。若細菌未生長，則或是不在明膠培養(yǎng)基上生長，或是基礎(chǔ)培養(yǎng)基不適宜。取新鮮種菌點種，適溫培養(yǎng)。平板呈藍黑，菌落四周圍如不變色或移開菌落后摘加新碘液，菌落下瓊脂仍不變色，表示淀粉水解陽性；如變色則為陰性。培養(yǎng) 1～7d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)；如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也產(chǎn)生氣泡則只能按可疑或陰性處理，不產(chǎn)生氣泡為陰性。每株菌做 3 個重復(fù)，另留兩管不接種作對照。結(jié)果觀察：當(dāng)培養(yǎng)液中滴入 A、B 液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究7鹽還原陽性。 碳源的利用培養(yǎng)基：(NH 4)2SO4 ，NaH 2PO4 ? H2O ，K 2HPO4 ，MgSO 4 ? 7H2O ，CaCl 2 ? 2H2O ，蒸餾水 1000ml，含碳化合物 ％，pH 177。適溫培養(yǎng) 14 天觀察。否則為陰性。如生長差別仍不明顯，則按陰性處理。制成的卵黃平板過夜后即可使用。在菌落四周圍和下面有不透明的區(qū)出現(xiàn)，表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶。用幼齡菌種穿刺接種，并用凡士林油封管，適溫培養(yǎng) 14 天觀察。 運動性的檢查半固體瓊脂穿刺法。細菌的運動性可用透過光目測。如生長物由穿刺線向四周呈云霧狀擴放，其邊緣呈云霧狀，則表示試驗菌株食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究8有運動性。如第一第不能判定可在第 2—3 天再觀察。因為游動力弱的細菌，在半固體培養(yǎng)基中第 12 天中尚不能從穿刺線游開，故需多培養(yǎng)幾天觀察。此時應(yīng)注意生長物的擴散情況，不可誤將不運動的細菌判為有運動性。 16S rDNA 序列提取及測序委托寶生物工程（大連）有限公司測序 變性在培養(yǎng)基中挑取菌體于 50ul TaKaRa Lysis Buffer for Microanism to Direct PCR(Code )中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件：94℃ 5 min 1 cycle 30 cycles????℃℃℃72℃ 5 min 1 cycle反應(yīng)體系:上述 1 的變性反應(yīng)液 1 ulPCR Premix 25 ulForward primer(20pmol/ul) Reverse primer2(20pmol/ul) 16Sfree H2O 23ul食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究9Total 50ul取 5 ul 進行 3%瓊脂糖凝膠電泳使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit （Code No. D823A）切膠回收目的片段進行 DNA 測序。 抑菌劑的篩選 細菌鑒定系統(tǒng)試劑卡藥敏鑒定 使用細菌鑒定系統(tǒng)中的藥敏試劑卡對病害菌進行多種抗生素的抑菌實驗。蓋上卡片蓋板，將卡片置于 35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 1624h 后，取出卡片，即可人工目測結(jié)果。本試驗采用紙碟法：取 用平板涂布法將菌混勻密布于生長培養(yǎng)基的平板，同時以無菌鑷子取含抗生素的紙片于含菌平板上，置 30℃培養(yǎng) 2448h 后，取出觀察抑菌圈大小。(05mm)無作用，(615mm) 弱作用，(15mm)強抑制作用 [14]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的料包在菌絲長滿之后進入出菇環(huán)節(jié)，經(jīng)過正常的消毒環(huán)節(jié)后，會長出子實體，但隨著子實體的增大，菇體會出現(xiàn)大量黃色粘稠狀水珠，隨著培養(yǎng)時間的延長，被污染的菇體最終會腐爛，而與之接觸的健康菇體也會被感染出現(xiàn)相同的癥狀。因此斷定，菌絲生長階段出現(xiàn)的黃色水珠與后期在子實體上的黃色液體為同一菌株的胞外分泌物。結(jié)果表明，兩個樣本的培養(yǎng)結(jié)果類似，均出現(xiàn)了兩種細菌，證實了這一污染現(xiàn)象是由兩種微生物引起，分別為 CTE 722B 和 CTE 722C；只是兩者比例有差異，前者 CTE 722C 較多，CTE722B 較少，后者則反之。食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究11圖 2 涂布培養(yǎng)結(jié)果 The result of polluted sample coated culture 病原菌的固體培養(yǎng)特征2 個菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生長 24h 后，觀察其形態(tài)特征見表 表 菌株 SS2 在 4 種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征比較菌株培養(yǎng)基S1 S2營養(yǎng)瓊脂 菌落圓形，半透明，乳白色，表面多皺，隆起，邊緣略粗糙菌落圓形，半透明，乳白色，邊緣整齊，光滑發(fā)亮LB 瓊脂 菌落圓形，半透明，杏仁白色，表面光滑濕潤，平坦，邊緣平整菌落圓形，半透明，乳白色，表面光滑濕潤，平坦，邊緣平整金氏等 A 培養(yǎng)基