【正文】 0 0 0 10 1 40 2 80 3 120 4 160 5 200 4 6 6 240 加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，在試管中分別加入 mL DNS 試劑，于沸水浴中加熱 5 min 進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水 mL，搖勻，用 721G 可見(jiàn)分光光度計(jì)，在 520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定 吸光度 。取出后置于冷水浴中冷卻，在 721G 型分光光度計(jì)上比色。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 8 頁(yè) 纖維素分解細(xì)菌的復(fù)篩 1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 7支 10 mL試管，編號(hào)，按表 （ 500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。 用 721G可見(jiàn)分光光度計(jì)，在 660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定 吸光度 。每 4 h取樣一次通 過(guò)分光光度法測(cè)定菌體濃度 。C 條件下保存， 以作下一步的研究 [15]。根據(jù)透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續(xù)進(jìn)行研究。C 、 50176。 細(xì)菌初篩 將純化的菌株接種到 纖維素鈉 (CMCNa)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基的上 ， 每個(gè)培養(yǎng)基點(diǎn) 2 個(gè)樣， 不同處理均作 3 個(gè)重復(fù)。 觀察培養(yǎng)皿上菌落形成情況，選取優(yōu)勢(shì)菌株和透明圈明顯的菌株， CMCNa培養(yǎng)基上用兩區(qū)劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離和純化 。C 及 50176。 7．革蘭氏碘液：碘 g、 碘化鉀 g、蒸餾水 mL，將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 mL。 6．濾紙紙 1 %醋酸浸泡 24 h，用碘液檢驗(yàn)確定無(wú)淀粉后。 5．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液的配制：將葡萄糖放在 110 176。 3．醋酸緩沖液 (pH )：取 g 冰醋酸鈉溶于 mL 蒸餾水中，用冰醋酸將該溶液的 pH 值調(diào)至 （ 約用 l2 mL） ，用蒸餾水定容至 mL。量取 0. 1 mol / L 檸檬溶液 89. 5 mL， 0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液110. 5 mL，混勻，即得 pH 4. 8 0. 1 mo l/ L的檸檬酸緩沖液。 主要試劑和儀器 試劑 1． DNS 試劑 甲液：溶解 6. 9 g結(jié)晶酚于 15. 2 mL、 10 % NaOH 溶液中， 并用水稀釋至 69 mL， 在此溶液中加 6. 9 g NaHSO3. 乙液： 稱取 255 g 酒石酸鉀鈉加到 mL、 1 0 % NaOH 溶液中， 再加入 mL、 1 % 3， 5二硝基水楊酸溶液 .將甲、乙二液相混合即得黃色試劑， 貯存于綜色 冰箱低溫保藏 1 周后使用。 以上培養(yǎng)基于 121176。3H2O g、 KH2PO4 g、 NH4NO3 g、 FeCl3 7．纖維素分解細(xì)菌產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液：羧甲基纖維素鈉 、 MgSO43H2O g、 MgSO4 5． 濾紙 崩解 培養(yǎng)基：蛋白胨 g、酵母膏 g、 NaCl g、蒸餾水 mL、調(diào) pH ，每 mL 培養(yǎng)基加入 mL 試管中，再加入濾紙（ 1cm6cm）。 3． LB 培養(yǎng)基 [14]： 蛋白胨 g、 NaCl g、酵母膏 g、蒸餾水 ml、調(diào) pH 。3H2O g、 MgSO4進(jìn)行一定的不同碳氮源、溫度、 pH 條件下的初略比較， 為下階段研究做準(zhǔn)備； 技術(shù)路線圖 酒糟、酒曲、酒醅、廢舊稻草、土壤樣品的采集制備保存 樣品 30℃下細(xì)菌分離培養(yǎng) 50℃下細(xì)菌分離培養(yǎng) 相關(guān)準(zhǔn)備工作 30℃、 50℃下預(yù)備試驗(yàn) 從樣品中分離、純化細(xì)菌 通過(guò)透明圈大小、濾紙潰爛度 初篩出具有分解纖維素的細(xì)菌菌株 對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定 進(jìn)行濾紙、羧甲基纖維素鈉酶活測(cè)定 鑒定命名保存篩選出的目標(biāo)菌落 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 5 頁(yè) 培養(yǎng)基 1．牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 [14]：牛肉膏 g、蛋白胨 g、瓊脂 ~ g、 NaCl g、蒸餾水 mL，調(diào) pH 。C 和 50176。C 及 50176。 因?yàn)槲⑸镌囼?yàn)的主要對(duì)象是微生物，其中空格部分的理化性質(zhì)是無(wú)需檢測(cè)的指標(biāo)，理化性質(zhì)只是作為最后結(jié)果的一個(gè)比較參考 。C 條件下保存。茅臺(tái)鎮(zhèn)被數(shù)目龐大的特殊微生物群籠罩其中，正是它們充當(dāng)了釀酒業(yè)的主力軍。C ，年日照時(shí)數(shù) 1400 h，無(wú)霜期 311 d，年降雨量800— 1000 mL。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 3 頁(yè) 2 材料與方法 供試樣地區(qū)域概況 樣品來(lái)源地 茅臺(tái) 鎮(zhèn)位于仁懷市 赤水河 畔，是茅臺(tái)酒、文臺(tái)酒的故鄉(xiāng)。 在纖維素利用的研究中， 研究的對(duì)象多偏重于厭氧高溫纖維素分解菌，好氧高溫纖維素分解菌涉及較少；研究?jī)?nèi)容多偏重于分類學(xué)方面以及菌株在厭氧發(fā)酵纖維素類物質(zhì)方面的應(yīng)用。 秦廣利等 [13]在酒糟中提取酒的研究也有了新發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明， 在殘?jiān)阒刑砑永w維素酶 10 U/g，于 58176。對(duì)酒糟發(fā)酵減重最高達(dá) 18%。最適產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵時(shí)間 72~ 96 h，發(fā)酵溫度 25~ 30176。 國(guó)內(nèi)外研究概況 在關(guān)于纖維素酶 活性及發(fā)酵時(shí)間、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響研究方面，江龍法等 [12]從白酒糟采集的樣品中初篩得到產(chǎn)纖維素酶酶活較高的 5 株菌。纖維小體附著在細(xì)菌細(xì)胞表面，所以細(xì)菌需要粘附在纖維上，使纖維小體在纖維的接觸點(diǎn)處對(duì)纖維素進(jìn)行水解，如熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。好氧細(xì)菌以可溶性胞外酶的形式分泌出 3種纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行水解， 如纖維桿菌屬 (Culmolnoas)的纖維單胞菌。研究最多的是纖維單胞菌（ Cellulomonas） [89]和熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。 纖維素分解細(xì)菌的簡(jiǎn)介 能產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌種類雖不如真菌， 生孢食纖維菌屬 ( Sporocytophaga ) 、有報(bào)道的食纖維菌 ( Cytophaga) 、 多囊纖維菌屬 ( Polyangiumcellulosum) 等屬細(xì)菌均有較強(qiáng)分解纖維素的能力 [6] 。因而，篩選纖維素酶比活力高的菌株無(wú)疑具有重要的意義。纖維素酶的比活力一般都很低，因而產(chǎn)酶成本高。 酒糟生物質(zhì)主要由 纖維素和木質(zhì)素 構(gòu)成 ，同時(shí)含有一定的殘余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白質(zhì) [3]，因此 ， 可利用具有降解纖維素的菌種對(duì)其進(jìn)行分解，把其中部分纖維素轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)等，從而提高酒糟的綜合利用效率 [4]。 關(guān)鍵詞： 纖維素分解細(xì)菌， 酶活性 ，纖維素酶，篩選 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） III Screening of Vinasse Cellulose Deposing Bacteria and Research on Enzyme Production ABSTRAC T 244 bacteria strains which could form a sharp and distinct zone around the cellulaseproducing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Gram’ s iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than , and among which, the radius ratio was more than were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL595 was the highest (). The strain number which the radius of distinct zone was more than cm under 30℃ and more than cm under 50℃ conditions was 20. In this study, 7 strains from 50℃ conditions and 6 strains from 30℃ conditions had been chosen to assay the active of cellulases and other index. The growth curve of strains test were cultured under 30℃ static culture and 50℃ oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions. However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50℃ oscillation conditions grew faster than the strains from 30℃ conditions during the earlier incubation stage, however, the growth from different conditions were consistency after incubation 3 d. The performance of strain BL516 from 30℃ conditions was better than the strains from 50℃ conditions. The cellulose active of BL5106 was the highest, which was U/mL. This study provides preparation and microbes for the posting experiment. Keywords: cellulose deposing bacteria, enzymatic activity, cellulase activity, screening 貴