【正文】 此時(shí)，誰也不會(huì)想到，最后我們會(huì)在這里留下那么多遺憾，此時(shí)的我們只會(huì)想到成功會(huì)屬于我們，也只可以屬于我們，因?yàn)槲覀冇凶詈玫膶?dǎo)師 。 又由于纖維素酶是一種誘導(dǎo)型復(fù)合酶系，單一菌株降解纖維素的能力有限，需要多菌種協(xié)同才有可能最大化地降解纖維素，所以本試驗(yàn)所獲菌株單獨(dú)降解纖維素能力可 能有所不足。 因纖維素空間結(jié)構(gòu)和纖維素酶酶系組成對(duì)纖維素分解效果影響顯著。 從試驗(yàn)中可以看出， 單菌株濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)證明單株細(xì)菌對(duì)濾紙條纖維素的分解能力比較弱， 通過 查閱有關(guān)文獻(xiàn)，知道有通過多菌種混合培養(yǎng)，利用不同菌種分泌的多種酶之間的協(xié)同作用，得到對(duì)濾紙條纖維素具有較強(qiáng)分解能力的菌 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 18 頁 株組合。C 培養(yǎng)條件下，前期，高溫培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)快于低溫培養(yǎng)，但 3d 之后，二者趨向平衡；后期， 30 176。在這 103株菌中，最具研究?jī)r(jià)值的有近 20株，本試驗(yàn)著重選取了其中 13株，分別是 50 176。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 15 頁 圖 葡萄糖 DNS 顯色反應(yīng) 濾紙條崩解實(shí)驗(yàn) 表 濾紙崩解試驗(yàn)情況 菌株編號(hào) 培養(yǎng)液沉淀 情況 顆粒物分布 狀況 菌落顏色 培養(yǎng)液液面有無菌落層 濾紙崩解狀 況 培養(yǎng)液渾濁 度 BH19 無 稀薄 極低 BH314 絮狀 均勻 少量 + 低 BH331 無 少量 極低 BH520 微量 下層較多 大量 極低 BH526 無 均勻 少量 極低 BH536 無 少量 極低 BH634 少量 稀薄 極低 BL345 中量 上層較多 黃色 無 + 低 BL465 少量 上層較多 灰色 少量 極低 BL5581 大量 上層較多 黃紅色 無 ++ 中度 BL595 中量 均勻 紅白交替 無 ++ 中度 BL599 中量 均勻 無 ++ 中度 BL5106 微量 均勻 無 +++ 高度 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 16 頁 上表 單菌株純培養(yǎng)崩解濾紙條試驗(yàn)結(jié)果，除了 2株細(xì)菌 BL5106一具有一定降解濾紙條的能力外，其他單菌株在連續(xù) 8d的恒溫振蕩培養(yǎng)過程中不能使濾紙條崩解，這也可能是培養(yǎng)時(shí)間不夠長(zhǎng)，或是濾紙成分構(gòu)成的原因。 纖維素分解細(xì)菌的復(fù)篩 結(jié)果 對(duì)具有纖維素分解功能的菌株分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定酶活力，其中菌株BL5106產(chǎn)纖維素酶活力最高，其酶活為 U/mL。 通過肉眼的觀察判斷， 50176。C 條件下，待到用時(shí)再取出，但要注意保存時(shí)間不宜過長(zhǎng)，通常為 7 d。C 3d BL345 30176。 表 明圈與菌落半徑比值及其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)情況。其中，菌落半徑最大的為 cm， BL595 透明圈與菌落半徑比值最大的，達(dá)到 15。在 560 nm 波長(zhǎng)處測(cè) 吸光度 并做好記錄。每次測(cè)酶活時(shí)均設(shè)一個(gè)總的空白樣，即在試管中不加底物和酶液，只加蒸餾水 mL，用作測(cè)量 吸光度 時(shí)的參比。 3．濾紙崩解 的測(cè)定 分別用接種環(huán)取一環(huán) 初篩得到的菌種，將其接種到 裝有 10 mL濾紙培養(yǎng)液 的10mL試管 中， 置于 30176。 根據(jù) DNS (3， 5二硝基水楊酸 )比色法測(cè)定原理繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 [16]。 然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以 OD值 為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。C 下 倒置 培養(yǎng) 2 d，每天檢測(cè)觀察各菌株的菌落狀況，最后通過滴加革蘭氏碘液， 靜置 10 min，傾去染液，將平板置于白色背景下，觀察透明圈產(chǎn)生的清晰度， 測(cè)量菌落及淺色透明圈半徑（ R， mm），并拍照記錄 。 主要儀器 儀器名稱 型號(hào) 生產(chǎn)廠商 冰箱 BCD215KALM 青島海爾股份有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DH6000BH 天津市泰斯特儀器有限公司 電子天平 ALB224 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司 單人單面凈化工作臺(tái) SW— CJ— 1FD 蘇州凈化設(shè)備有限公司 恒溫振蕩器 ZD— 85A 常州澳華儀器有限公司 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 101— 2AB 天津市泰斯特儀器有限公司 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG— 9240 上海一恒科技有限公司 紫外可見分光光度計(jì) 721GG 上海儀電分析儀器有限公司 高速臺(tái)式離心機(jī) TGL— 16B 上海安亭科學(xué)儀器廠 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 7 頁 方法 分離、純化 將從貴州茅臺(tái)酒廠取樣到的樣品搗碎后，取適量濾液接 取 g樣品于 mL無菌水中制備成 1%的菌懸液，震蕩培養(yǎng) 30 min用無菌蒸餾水稀釋 10 1010 105四個(gè)梯度，然后再用無菌吸管吸取 100 μL菌懸液滴入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布均勻，分別在 30 176。量取 0. 1 mo l/ L檸檬酸溶液 57 mL， 0. 1 mol / L 檸檬酸三鈉溶液 mL，再量取 mL蒸餾水 混勻，配成 pH4. 0. 05 mol / L 的檸檬酸緩沖液。7H2O g、 CaCl2 g、 K2HPO47H2O g、 NaNO3 g、 KCl g、瓊脂 g、蒸餾水 ，調(diào) pH 。 表 樣品基本理化性質(zhì) 樣品名稱 含水率 有機(jī) C 有機(jī)質(zhì) pH 全 K 速效 K 全 P 全 N 堿解 N % g/kg g/kg mg/kg mg/kg % g/kg mg/km 茅臺(tái)酒糟 301 車間酒糟 茅臺(tái)大曲 茅臺(tái)酒醅 1 茅臺(tái)有機(jī)高粱基地土壤 廢舊稻草 小麥粉 里村組土壤 里列組土壤 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 4 頁 研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線 主要研究?jī)?nèi)容 1．試驗(yàn)在 30176。 平均海拔高度 880 m，年平均氣溫 176。C 。根據(jù)細(xì)菌的生理學(xué)特性，一般將纖維素降解細(xì)菌分類為：厭氧型、好氧型和好氧滑動(dòng)菌。 對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌的研究過去多集中于真菌的研究和應(yīng)用，鑒于細(xì)菌繁殖和產(chǎn)酶速度快、發(fā)酵周期短，有利于工業(yè)生產(chǎn)，故近年來對(duì)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶日益引起重視。C和 30℃培養(yǎng)篩選條件下 選取 7株 和 6株，對(duì) 這些菌株 進(jìn)行 纖維素酶活及其他 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。 本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 論文（設(shè)計(jì)）題目：降解酒糟生物質(zhì)的纖維素分解細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶研究 學(xué) 院： 農(nóng) 學(xué) 院 ＿ 專 業(yè)： 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境 班 級(jí)： ＿ 09 農(nóng) 資＿ ＿ 學(xué) 號(hào)： ＿ 0909010165 ＿ 學(xué)生姓名： ＿ ＿ ＿＿ 指導(dǎo)教師： ＿ ＿ 20xx 年 5 月 28 日 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 誠(chéng)信責(zé)任書 本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業(yè) 論文（設(shè)計(jì)） ，是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所完成。 菌株的生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)分別在 30℃（中溫）條件下靜置培養(yǎng)和 50℃（高溫）條件下振蕩進(jìn)行培養(yǎng)。纖維素酶的比活力一般都很低，因而產(chǎn)酶成本高。好氧細(xì)菌以可溶性胞外酶的形式分泌出 3種纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行水解， 如纖維桿菌屬 (Culmolnoas)的纖維單胞菌。對(duì)酒糟發(fā)酵減重最高達(dá) 18%。C ，年日照時(shí)數(shù) 1400 h，無霜期 311 d，年降雨量800— 1000 mL。C 及 50176。 3． LB 培養(yǎng)基 [14]： 蛋白胨 g、 NaCl g、酵母膏 g、蒸餾水 ml、調(diào) pH 。3H2O g、 KH2PO4 g、 NH4NO3 g、 FeCl3 3．醋酸緩沖液 (pH )：取 g 冰醋酸鈉溶于 mL 蒸餾水中，用冰醋酸將該溶液的 pH 值調(diào)至 （ 約用 l2 mL） ，用蒸餾水定容至 mL。C 及 50176。根據(jù)透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續(xù)進(jìn)行研究。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 8 頁 纖維素分解細(xì)菌的復(fù)篩 1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 7支 10 mL試管，編號(hào)，按表 （ 500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。 2． 粗酶液制備 將初篩選取的菌株環(huán)取一環(huán)接種到纖維素羧甲基鈉活化培養(yǎng)液中， 30176。C 、 50176。對(duì)每個(gè)樣品都設(shè)一個(gè)參照樣，先加 mL 蒸餾水，后加 mL 相應(yīng)樣品的粗酶液。定義每分鐘催化纖維素水解生成 1 μg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位， 即 在 50176。透明圈與菌落半徑比值超過 10 的有 12 株，透明圈與菌落半徑比值超過 5 的有 103 株。 表 初篩中 13株細(xì)菌 透明圈與菌落半徑比值 樣品編號(hào) 菌落半徑（ cm） 透明圈半徑 （ cm） 透明圈與菌落半徑比值 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時(shí)間 BH19 50176。C 3d BL465 30176。 做長(zhǎng)期保存則是 將菌種接種到斜邊保存基上， 4176。C 、 120 r /min 振蕩培養(yǎng) 下的菌種，其吸光度因顆粒分布不均，必然無法準(zhǔn)確測(cè)定。 將分離到的 13 株菌分別接種一環(huán)到裝有 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中， 30 176。 結(jié)合生長(zhǎng)曲線測(cè)定的 OD可以推斷，液體渾濁度高的相對(duì)的 OD就大，對(duì)濾紙的分解能力相應(yīng)也會(huì)較強(qiáng)。C條件篩選的 7株和 30 176。C 條件下篩選的部分菌株（ BL5106）性能優(yōu)于 50 176。這說明纖維素的有效分解需要多菌種分泌多種酶的協(xié)同參與。經(jīng)高溫蒸餾的酒糟中纖維素的晶狀結(jié)構(gòu)被部分破壞，有利于纖維素酶的作用。 通過以上試驗(yàn)，對(duì)所篩選的細(xì)菌有做了進(jìn)一步的淘汰，在得到 1株較為高效的纖維素分解菌的同時(shí)，也建立了初步的探究模式，這為 下一步的工作創(chuàng)造了便利。 而事實(shí)證明 ，沒有足夠的努力，就不會(huì)有最好的結(jié)果。我們?cè)O(shè)計(jì)思路，制定方案，清洗儀器，準(zhǔn)備 器材，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室也迎來了第一批客人，茅臺(tái)酒廠派來的 “ 監(jiān)工 ” ，我們一起開始了菌種的分離。產(chǎn)纖維素酶酶活和濾紙酶活高的菌株分解酒糟的效率不一定好。更為主要的是這種方法