【正文】 nd Research on Enzyme Production ABSTRAC T 244 bacteria strains which could form a sharp and distinct zone around the cellulaseproducing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Gram’ s iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than , and among which, the radius ratio was more than were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL595 was the highest (). The strain number which the radius of distinct zone was more than cm under 30℃ and more than cm under 50℃ conditions was 20. In this study, 7 strains from 50℃ conditions and 6 strains from 30℃ conditions had been chosen to assay the active of cellulases and other index. The growth curve of strains test were cultured under 30℃ static culture and 50℃ oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions. However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50℃ oscillation conditions grew faster than the strains from 30℃ conditions during the earlier incubation stage, however, the growth from different conditions were consistency after incubation 3 d. The performance of strain BL516 from 30℃ conditions was better than the strains from 50℃ conditions. The cellulose active of BL5106 was the highest, which was U/mL. This study provides preparation and microbes for the posting experiment. Keywords: cellulose deposing bacteria, enzymatic activity, cellulase activity, screening 貴 貴州大學本科畢業(yè)論文（設計） 第 1 頁 1 前言 研究意義及目的 酒糟是釀酒業(yè)最主要的副產(chǎn)物， 在 我國 ， 每年白酒酒糟產(chǎn)量都在 2500 萬 t以上 [1]。由于酒糟酸度 偏 大，可生化性 較較 強，極易腐爛，不便存儲，若不及時處理，易對環(huán)境造成極大的污染 [2]。 酒糟生物質主要由 纖維素和木質素 構成 ，同時含有一定的殘余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白質 [3]，因此 ， 可利用具有降解纖維素的菌種對其進行分解，把其中部分纖維素轉化為有機質等，從而提高酒糟的綜合利用效率 [4]。 對纖維素酶產(chǎn)生菌的研究過去多集中于真菌的研究和應用，鑒于細菌繁殖和產(chǎn)酶速度快、發(fā)酵周期短，有利于工業(yè)生產(chǎn)，故近年來對細菌產(chǎn)纖維素酶日益引起重視。纖維素酶的比活力一般都很低，因而產(chǎn)酶成本高。據(jù)估計，纖維素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相應水解所需的酶蛋白多 100 倍，這是影響纖維素酶實際應用的重要原因之一 [5]。因而，篩選纖維素酶比活力高的菌株無疑具有重要的意義。 本試驗針對酒糟生物質降解慢的難題，擬從茅臺酒廠提供的樣品中分離細菌，篩選出酶活性較高的纖維素細菌菌株，對篩選的菌株進行產(chǎn)酶特性初步研究，以此為依據(jù) 優(yōu)化產(chǎn)酶條件，以期為酒糟綜合利用研究提供科學依據(jù)。 纖維素分解細菌的簡介 能產(chǎn)纖維素酶的細菌種類雖不如真菌， 生孢食纖維菌屬 ( Sporocytophaga ) 、有報道的食纖維菌 ( Cytophaga) 、 多囊纖維菌屬 ( Polyangiumcellulosum) 等屬細菌均有較強分解纖維素的能力 [6] 。 酶活較強的菌種有纖維桿菌屬 (Culmolnoas)、生孢纖維菌屬 (sporocytophaga)[7]和梭菌屬 (cellulomonas)。研究最多的是纖維單胞菌（ Cellulomonas） [89]和熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。根據(jù)細菌的生理學特性，一般將纖維素降解細菌分類為：厭氧型、好氧型和好氧滑動菌。好氧細菌以可溶性胞外酶的形式分泌出 3種纖維素酶對纖維素進行水解， 如纖維桿菌屬 (Culmolnoas)的纖維單胞菌。 貴 貴州大學本科畢業(yè)論文（設計） 第 2 頁 厭氧細菌將 3 種纖維素酶 以特定方式 聯(lián)合組裝成一個大復合體 — 纖維小體(cenulosome)[10]，具有多種功能的超分子結構。纖維小體附著在細菌細胞表面，所以細菌需要粘附在纖維上，使纖維小體在纖維的接觸點處對纖維素進行水解，如熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）。研究表明，細菌在降解纖維素過程中產(chǎn)生纖維素酶的量較少，且大多不能分泌到細菌細胞外，其大多數(shù)對結晶纖維素沒有活性， 在降解纖維素 能力 方面，細菌 明顯低于真菌，因此 ， 很少將細菌投入到工業(yè)生產(chǎn)中 [11]。 國內(nèi)外研究概況 在關于纖維素酶 活性及發(fā)酵時間、溫度對產(chǎn)酶的影響研究方面，江龍法等 [12]從白酒糟采集的樣品中初篩得到產(chǎn)纖維素酶酶活較高的 5 株菌。纖維素酶和濾紙酶活研究結果表明，這 5 株菌在分泌纖維素酶活力及降解濾紙能力方面均較強，其分解纖維素的酶活最高達到 U/ mL，而分解濾紙的酶活力則最高達到 64 U/ mL。最適產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵時間 72~ 96 h，發(fā)酵溫度 25~ 30176。C 。對酒糟發(fā)酵減重最高達 18%。 李日強等 [12]通過對發(fā)酵處理后的玉米秸稈和白酒糟的分析，玉米秸稈經(jīng)發(fā)酵處理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸總量分別比發(fā)酵處理前高了 %， %和 %；白酒糟經(jīng)發(fā)酵處理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸總量分別比發(fā)酵處理前高了 %， %和 %，而且都具有較高的半纖維素酶和纖維素酶活性，可對秸稈和白酒糟進行持續(xù)降解，進一步提高了消化率。 秦廣利等 [13]在酒糟中提取酒的研究也有了新發(fā)現(xiàn)，結果表明， 在殘糟中添加纖維素酶 10 U/g，于 58176。C 的水浴鍋中保持 5 h，可以提高還原糖的含量，殘 糟發(fā)酵酒精度達到 %vol，出酒率達到 %，出酒率比原糟提高了 %，蒸餾出的產(chǎn)品達到蒸餾白酒各項衛(wèi)生指標，達到優(yōu)質醬香白酒的要求，提高了醬香型白酒酒糟的利用價值。 在纖維素利用的研究中， 研究的對象多偏重于厭氧高溫纖維素分解菌，好氧高溫纖維素分解菌涉及較少；研究內(nèi)容多偏重于分類學方面以及菌株在厭氧發(fā)酵纖維素類物質方面的應用。 酒糟的利用研究也有進展，歸納起來，主要是通過生物法，將酒糟發(fā)酵為動物飼料，或從中再提取酒精，再有就是發(fā)酵為有機肥這幾大個方面，并從其中衍生出其他的發(fā)展方向。 貴 貴州大學本科畢業(yè)論文（設計） 第 3 頁 2 材料與方法 供試樣地區(qū)域概況 樣品來源地 茅臺 鎮(zhèn)位于仁懷市 赤水河 畔，是茅臺酒、文臺酒的故鄉(xiāng)。 平均海拔高度 880 m，年平均氣溫 176。C ，年日照時數(shù) 1400 h，無霜期 311 d，年降雨量800— 1000 mL。茅臺鎮(zhèn)地處河谷，風速小，冬暖、夏熱、少雨、少風的特殊小氣候十分有利于釀造茅臺酒 微生物 的棲息和繁殖。茅臺鎮(zhèn)被數(shù)目龐大的特殊微生物群籠罩其中，正是它們充當了釀酒業(yè)的主力軍。 采集的樣品放入塑料袋中，封口，置于冰箱中 4176。C 條件下保存。 樣品基本理化性質 表 為茅臺酒廠提供的酒糟、 301 車間酒糟、酒曲、酒醅、茅臺有機高粱基地土壤、廢舊稻草等樣品的基本理化性質。 因為微生物試驗的主要對象是微生物，其中空格部分的理化性質是無需檢測的指標，理化性質只是作為最后結果的一個比較參考 。 表 樣品基本理化性質 樣品名稱 含水率 有機 C 有機質 pH 全 K 速效 K 全 P 全 N 堿解 N % g/kg g/kg mg/kg mg/kg % g/kg mg/km 茅臺酒糟 301 車間酒糟 茅臺大曲 茅臺酒醅 1 茅臺有機高粱基地土壤 廢舊稻草 小麥粉 里村組土壤 里列組土壤 貴 貴州大學本科畢業(yè)論文（設計） 第 4 頁 研究內(nèi)容和技術路線 主要研究內(nèi)容 1．試驗在 30176。C 及 50176。C 培養(yǎng)條件下，從茅臺酒丟糟、 301 車間丟糟、酒曲、酒醅、茅臺有機高粱基地土壤、廢舊稻草樣品中分離細菌； 2．對分離得到的菌株分別于 30176。C 和 50176。C 下，采用羧甲基纖維素鈉鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基進行初篩； 3．對初篩得到的菌株進行 生長曲線的測繪，以及 濾紙酶活力（ FPA） 、 羧甲基纖維素鈉酶活力（ CMC）的 測定，篩選出纖 維素酶酶活性最高的菌株保存。進行一定的不同碳氮源、溫度、 pH 條件下的初略比較， 為下階段研究做準備； 技術路線圖 酒糟