【正文】 測量吸光值(波長為540 nm，以濃度為0 μg/ml的葡萄糖反應(yīng)液體作空白對照)。配制方法：將葡萄糖放在80 ℃烘干箱內(nèi)烘干至恒重， g葡萄糖固體溶解于少量蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至20 ml，充分混勻，得濃度為2 mg/ml的葡萄糖標準溶液。 (4) 觀察將純化得到的纖維素降解菌進行觀察對比并記錄生長情況。 (3) 再次挑菌：將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到羧甲基培養(yǎng)基的平面上，置28 ℃29 ℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，觀察水解圈情況，將菌落用l mg/l果紅染色5 min，將顏色變紅的菌落繼續(xù)劃線分離。 菌株的復(fù)篩 （1）配CMC培養(yǎng)基，滅菌，倒平板。檢查菌苔是否單純也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)物。(4) 培養(yǎng)將培養(yǎng)基平板倒置于28 ℃溫室中培養(yǎng)3日。 (2) 制備土壤稀釋液：稱取土樣10 g，放入盛90 ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。 (16) 保藏用真菌PDA培養(yǎng)基(g/l)：200 g馬鈴薯加水1000 mL煮費后，再小火煮30 rnin，8層紗布過濾，加蔗糖20 g，補水1000 ml，pH 。其中，蔗糖易在高溫下被分解為葡萄糖和果糖，故采用過濾除菌的方法滅菌。4H2O g，蒸餾水1000 mL，pH 自然值。7H2O g，ZnSO47H2O g，CuSO4 (13) 硝酸鹽還原培養(yǎng)基：琥珀酸鈉 10 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 g，KCl g，蒸餾水 1000 mL，pH ，分裝于試管中，121 ℃滅菌20 min。7H2O g，K2HPO4 g，NaCl g，KNO3 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1000 mL，pH ，121 ℃滅菌20 min。 (10) 明膠液化培養(yǎng)基：蛋白胨 g， g，明膠 200 g，蒸餾水1000 mL，pH ，121 ℃滅菌20 min。.H2O g, CaCl2 (9) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：(NH4)2SO4 2 g，MgSO47H2O), g， g， g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 ml。制法：馬鈴薯去皮后，切成小塊，加水煮爛（煮沸20~30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4層紗布過濾，再加糖和瓊脂，加熱融化后飛、再補足水分至1000 ml, 121 ℃下滅菌20 min。7H2O g，瓊脂15 g， g， g， g，蒸餾水1000 ml，PH值自然。(4) 濾紙條培養(yǎng)基：試管中加入上述無機鹽溶液5 ml，加1條瓦特曼濾紙（6cm1cm）垂直立于試管中，并使一部分露出液面，加棉塞121 ℃ 30 min滅菌。 (2) 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基II：CMC 20 g，Na2HPO4 g，KH2PO4 g， g， g，水1000 ml，瓊脂20 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。 培養(yǎng)基 (1) 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基I：CMC 20 g，NaCl g，MgSO4(6)1 %CMC溶液：取l g CMC粉末緩慢的加到l00 ml pH ，邊加邊攪拌，并用熱水浴使其充分溶解，轉(zhuǎn)于試劑瓶并放冰箱保存。(4) M檸檬酸： g檸檬酸加水溶解，定容至250 ml, pH 。(3) M Na2HPO4溶液： g Na2HPO4H2OAR國藥集團化學(xué)試劑有限公司瓊脂AR武漢鼎國生物技術(shù)有限公司注：(1) AR: Analytical reagent 分析純試劑(2) 主要分子生物學(xué)試劑見具體實驗方法部分(1) DNS試劑：稱取5 g 3,5二硝基水楊酸溶于蒸餾水中，加入10 g氫氧化鈉，100 g酒石酸鉀鈉和250 ml水，加熱溶解后再加入結(jié)晶酚1 g， g，待全部溶解后冷卻，定容至500 ml，貯于棕色瓶中，放置一周后使用，使用前過濾。2H2OAR天津市天力化學(xué)試劑有限公司剛果紅C32H22N6Na2O6S2AR湖南湘大化工試劑有限公司檸檬酸C6H8O77H2OAR天津市化學(xué)試劑三廠硫酸錳MnSO46H2OAR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司硫酸亞鐵FeSO43H2OAR天津市東麗區(qū)泰蘭德化學(xué)試劑廠磷酸二氫鉀KH2P04AR天津市東麗區(qū)泰蘭德化學(xué)試劑廠硝酸鈉NaNO3AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司硫酸鎂MgSO4AR上海試一化學(xué)試劑有限公司氯化鈣CaCl2AR天津市天達凈化材料精密化工廠氯化鈉NaClAR天津市凱通化學(xué)試劑有限公司氯化鉀KCl2 實驗部分 材料 樣品來源微生物分離樣品來自廣西香蕉秸稈的土壤，武漢武豐宰牛廠牛的瘤胃，武漢晨鳴造紙廠的污水排放口的污泥以及漢陽江邊的土壤。并從形態(tài)學(xué)和生理生化等方面對篩得的菌株進行菌種鑒定。這些堿基突變引起氨基酸序列的改變有可能導(dǎo)致兩個菌株纖維素酶產(chǎn)量上的不同。通過聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)擴增得到纖維素酶高產(chǎn)菌株芽孢桿菌(Bacillus sp)。纖維分解細菌經(jīng)離子束注入誘變，其突變菌株產(chǎn)纖維素酶活性也明顯提高。韓峰等[11]以擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)TH為出發(fā)菌株，采用紫外誘變獲得一株抗高濃度葡萄糖阻遏突變株UVIII，纖維素酶產(chǎn)量顯著提高。Hideo等[10] %秋水仙素處理35 d的里氏木霉(Trichoderma reese)RUTC230，用滅菌靈單倍體化，從單倍體克隆長成的分生孢子器中分離出高產(chǎn)纖維素酶菌株，隨后分別用含有1%廢紙粉的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基和含有1%的微晶纖維素的培養(yǎng)基作為二級選擇培養(yǎng)基進行篩選。 纖維素分解菌的選育 近年來，在纖維素分解菌研究領(lǐng)域，還有人通過對已發(fā)現(xiàn)纖維素分解菌進行誘變，來增加產(chǎn)酶微生物菌種資源，提高纖維素酶的產(chǎn)量，并取得了較大的進步[9]。同年，韓紹印等從造紙廠廢紙漿中分離到一株纖維素降解細菌CP4，在溫度為2050 ℃和PH為510的條件下，CP4能夠快速生長并分泌纖維素酶。2007年，劉玉承等從日糧精粗比為3:7的小尾寒羊蒙古羊雜交一代綿羊的瘤胃內(nèi)容物中分離到2株嚴格厭氧細菌，二者對濾紙有很好的降解能力。該菌株呈長桿狀，革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)芽孢，命名為BSX5。2006年，伍時華等通過羧甲基纖維素瓊脂平板、濾紙條培養(yǎng)基從自然環(huán)境中篩選到4株高效纖維素降解菌，其中木霉2株，青霉2株，分別記為T1，T2，P1和P2。并測定其水解圈大小。結(jié)果從牛糞中分離出35株兼性厭氧的芽孢桿菌。利用剛果紅平板染色法分離篩選具有產(chǎn)纖維素酶活性的芽孢桿菌。2005年，Souichiro Kato等構(gòu)建了由五種細菌(梭菌屬菌株CSKl，梭菌屬菌株FG4，短芽孢菌屬菌株M1和博爾德氏桿菌屬菌株M1)組成的可降解纖維素的群落(命名為SF356)，該群落經(jīng)20次繼代培養(yǎng)它們?nèi)阅芊€(wěn)定共存，并且降解纖維素的能力增強了。2002年，崔宗均等從4種堆肥樣品中分別篩選出纖維素分解能力較強的4組混合菌，再以酸堿反應(yīng)互補的原則重新優(yōu)化組合并馴化成組纖維素分解能力非常強而穩(wěn)定的纖維素分解菌復(fù)合系MCl。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)、生態(tài)特性和遺傳型的鑒定，(Rum inococcus)的黃色瘤胃球菌(Rum inococcus flavefaciens)。其中，以細菌的生長和降解效果較穩(wěn)定。 纖維素分解菌類 纖維素分解菌類簡介自然界能產(chǎn)生分解纖維素的酶的微生物很多，包括細菌、放線菌和真菌[5]。協(xié)同作用一般認為是內(nèi)切葡萄糖酶首先進攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成外切纖維素酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位，β葡萄糖苷酶再對纖維二糖單位進行水解，形成葡萄糖。Wood在研究木霉(Trichodermareesei)、青霉(Penicilli, umfuniculosumde)的纖維素酶水解纖維素時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的兩種外切酶在液化微晶纖維素和棉纖維時具有協(xié)同作用。雖然它對纖維素?zé)o作用，但它可以消除上述兩種酶催化反應(yīng)的終產(chǎn)物對反應(yīng)的抑制作用，從而加快反應(yīng)速度。這類酶作用于纖維素分子末端，水解β1,4糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子； 第三類是β葡萄糖苷酶(β1,4glucanase,EC )，或稱纖維素二糖酶。可分為以下三類： 第一類是葡聚糖內(nèi)切酶，或稱CMC酶或CX酶。 纖維素酶的種類以及作用機理 微生物分解纖維素依賴于細胞所產(chǎn)生的纖維素酶。因此，在纖維素溶解糖化過程中與CBH的比值會顯著地影響纖維素溶解活力，而且在纖維素糖化過程中CB組分的加入會使這種協(xié)同作用大大加強。嚴格地講，葡萄糖苷酶不能算作纖維素酶，但它可以減輕纖維二糖對纖維素酶的反饋抑制作用。β1,4D葡萄糖苷酶(6glucosidases,B6或BG)或BD葡萄糖苷葡萄糖水解酶()，又稱纖維二糖酶(cellobiase,CB)，它主要裂解纖維二糖和從小的纖維素糊精的非還原末端水解葡萄糖殘基，生成葡萄糖產(chǎn)物。內(nèi)切纖維素酶(endoglueanases,EG)或內(nèi)切葡聚糖酶，即內(nèi)切β1,4D葡聚糖q葡聚糖水解酶(endo8glucanasea,)，簡稱內(nèi)切酶，也稱cx酶，CMC酶。根據(jù)它們作用于纖維素和降解的中間產(chǎn)物可以分為三類：外切葡聚糖酶包括兩類酶，一類是β1,4D葡聚糖葡萄糖水解酶，也稱為纖維素糊精酶()；第二類酶為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases, CBH)，即β1,4D葡聚糖纖維二糖水解酶(exoβ1,4Dglucanas