【正文】 為保存培養(yǎng)基。C3dBL599 30176。C3dBL5581 30176。C3dBL345 30176。C3dBH536 50176。C3dBH520 50176。C3dBH314 50176。 其中BL5581是在純化BL558時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)透明圈半徑比: BL558更大，就一直以此命名。共選取13株菌進(jìn)行纖維素酶活力等測(cè)定。C培養(yǎng)條件下的，選取透明圈半徑超過(guò)2 cm，透明圈與菌落半徑比值大于3的7株菌；30176。透明圈與菌落半徑比值超過(guò)10的有12株，透明圈與菌落半徑比值超過(guò)5的有103株。通過(guò)對(duì)近千個(gè)菌株的初篩，用羧甲基纖維素鈉鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，滴加革蘭氏碘液有透明圈的244株。細(xì)菌的純化一般采用二區(qū)劃線法，通過(guò)這種方式，進(jìn)一步分離所篩選的菌種。葡萄糖量=[(mg/mL)?30 min]1/10式中 葡萄糖量：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的（mg）；1/10： 稀釋倍數(shù)；30： 糖化時(shí)間（min）。定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位，即在50176。迅速冷卻試管， mL。C恒溫水浴加熱，充分反應(yīng)30 min。C和30176。對(duì)每個(gè)樣品都設(shè)一個(gè)參照樣， mL蒸餾水， mL相應(yīng)樣品的粗酶液。還原糖的測(cè)定：取刻度試管26只， mL，CMC緩沖液（檸檬酸緩沖液） mL。若濾紙不到2 4 h 全部分解，則記下達(dá)到全部被分解的時(shí)間，拍照記錄。觀察其酶活力的分解強(qiáng)度，以+、—標(biāo)示作用情況，本方法是以肉眼觀察為主，主觀意識(shí)為主，結(jié)果的表示只能為試驗(yàn)提供參考，不能作評(píng)判的依據(jù)，但用于篩選目標(biāo)菌株有很大的適用性，再配以其他方法，不是為有效的手段。C、50176。在520 nm 處測(cè)OD 值，測(cè)得OD 值后查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出酶解所得葡萄糖含量，換算成酶活力值。CMC酶活力的測(cè)定：取CMC mL于比色皿中， mL 稀釋10 倍的酶液，50176。C則在120 r /min下振蕩培養(yǎng)24 h，不同處理做3個(gè)重復(fù)。2．粗酶液制備將初篩選取的菌株環(huán)取一環(huán)接種到纖維素羧甲基鈉活化培養(yǎng)液中，30176。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的制備管號(hào)制備標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的濃度（μg/mL）加500ug/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄液（mL）加蒸餾水量（mL）00010140280312041605200466240加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水， mL DNS試劑，于沸水浴中加熱5 min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻， mL，搖勻，用721G可見(jiàn)分光光度計(jì)，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。取出后置于冷水浴中冷卻，在721G型分光光度計(jì)上比色。 1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取7支10 mL試管，編號(hào)，（500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。用721G可見(jiàn)分光光度計(jì)，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每4 h取樣一次通過(guò)分光光度法測(cè)定菌體濃度。C條件下保存，以作下一步的研究[15]。根據(jù)透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續(xù)進(jìn)行研究。C、50176。將純化的菌株接種到纖維素鈉(CMCNa)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基的上，每個(gè)培養(yǎng)基點(diǎn)2 個(gè)樣，不同處理均作3個(gè)重復(fù)。觀察培養(yǎng)皿上菌落形成情況，選取優(yōu)勢(shì)菌株和透明圈明顯的菌株，CMCNa培養(yǎng)基上用兩區(qū)劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離和純化。C及50176。 7．革蘭氏碘液： g、 g、 mL，將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后， mL。6．濾紙紙1 %醋酸浸泡24 h，用碘液檢驗(yàn)確定無(wú)淀粉后。5．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將葡萄糖放在110 176。3．醋酸緩沖液(pH )： mL蒸餾水中，（約用l2 mL）， mL。量取0. 1 mol / L 檸檬溶液89. 5 mL，0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液110. 5 mL，混勻，即得pH 4. 80. 1 mo l/ L的檸檬酸緩沖液。1．DNS 試劑甲液：溶解6. 9 g結(jié)晶酚于15. 2 mL、10 % NaOH 溶液中， 并用水稀釋至69 mL， 在此溶液中加6. 9 g NaHSO3. 乙液： 稱(chēng)取255 g mL、1 0 % NaOH 溶液中， mL、1 % 3，、乙二液相混合即得黃色試劑， 貯存于綜色冰箱低溫保藏1周后使用。以上培養(yǎng)基于121176。3H2O g、KH2PO4 g、NH4NO3 g、FeCl37．纖維素分解細(xì)菌產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液：、MgSO43H2O g、MgSO45． 濾紙崩解培養(yǎng)基： g、 g、NaCl g、 mL、調(diào)pH ， mL試管中，再加入濾紙（1cm6cm）。3．LB培養(yǎng)基[14]： g、NaCl g、 g、 ml、調(diào)pH 。3H2O g、MgSO4進(jìn)行一定的不同碳氮源、溫度、pH條件下的初略比較，為下階段研究做準(zhǔn)備；酒糟、酒曲、酒醅、廢舊稻草、土壤樣品的采集制備保存樣品30℃下細(xì)菌分離培養(yǎng)50℃下細(xì)菌分離培養(yǎng)相關(guān)準(zhǔn)備工作30℃、50℃下預(yù)備試驗(yàn)從樣品中分離、純化細(xì)菌通過(guò)透明圈大小、濾紙潰爛度初篩出具有分解纖維素的細(xì)菌菌株對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定進(jìn)行濾紙、羧甲基纖維素鈉酶活測(cè)定鑒定命名保存篩選出的目標(biāo)菌落1．牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[14]： g、 g、~ g、NaCl g、 mL，調(diào)pH 。C和50176。C及50176。因?yàn)槲⑸镌囼?yàn)的主要對(duì)象是微生物，其中空格部分的理化性質(zhì)是無(wú)需檢測(cè)的指標(biāo)，理化性質(zhì)只是作為最后結(jié)果的一個(gè)比較參考。C條件下保存。茅臺(tái)鎮(zhèn)被數(shù)目龐大的特殊微生物群籠罩其中，正是它們充當(dāng)了釀酒業(yè)的主力軍。C，年日照時(shí)數(shù)1400 h，無(wú)霜期311 d，年降雨量800—1000 mL。2材料與方法樣品來(lái)源地茅臺(tái)鎮(zhèn)位于仁懷市赤水河畔，是茅臺(tái)酒、文臺(tái)酒的故鄉(xiāng)。在纖維素利用的研究中，研究的對(duì)象多偏重于厭氧高溫纖維素分解菌，好氧高溫纖維素分解菌涉及較少；研究?jī)?nèi)容多偏重于分類(lèi)學(xué)方面以及菌株在厭氧發(fā)酵纖維素類(lèi)物質(zhì)方面的應(yīng)用。秦廣利等[13]在酒糟中提取酒的研究也有了新發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明，在殘?jiān)阒刑砑永w維素酶10 U/g，于58176。對(duì)酒糟發(fā)酵減重最高達(dá)18%。最適產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵時(shí)間72~ 96 h，發(fā)酵溫度25~ 30176。在關(guān)于纖維素酶活性及發(fā)酵時(shí)間、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響研究方面，江龍法等[12]從白酒糟采集的樣品中初篩得到產(chǎn)纖維素酶酶活較高的5株菌。纖維小體附著在細(xì)菌細(xì)胞表面，所以細(xì)菌需要粘附在纖維上，使纖維小體在纖維的接觸點(diǎn)處對(duì)纖維素進(jìn)行水解，如熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）。好氧細(xì)菌以可溶性胞外酶的形式分泌出3種纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行水解， 如纖維桿菌屬(Culmolnoas)的纖維單胞菌。研究最多的是纖維單胞菌（Cellulomonas）[89]和熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）。能產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌種類(lèi)雖不如真菌，生孢食纖維菌屬( Sporocytophaga ) 、有報(bào)道的食纖維菌( Cytophaga) 、多囊纖維菌屬( Polyangiumcellulosum) 等屬細(xì)菌均有較強(qiáng)分解纖維素的能力[6] 。因而，篩選纖維素酶比活力高的菌株無(wú)疑具有重要的意義。纖維素酶的比活力一般都很低，因而產(chǎn)酶成本高。酒糟生物質(zhì)主要由纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，同時(shí)含有一定的殘余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白質(zhì)[3]，因此，可利用具有降解纖維素的菌種對(duì)其進(jìn)行分解，把其中部分纖維素轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)等，從而提高酒糟的綜合利用效率[4]。關(guān)鍵詞：纖維素分解細(xì)菌，酶活性，纖維素酶，篩選Screening of