【正文】 量最大的可再生資源（占光合作用產(chǎn)物 90%以上） [4]。這些氣體都被排入了大氣中，但使用生物質(zhì)能源可以有效減少這些氣體的排放 [2]。在使用化石燃料的過程中，生成了大量的CO， CO2 等氣體。根據(jù)已探明的儲量和現(xiàn)在的開采開發(fā)速度預(yù)計，全球化石燃料僅夠維持大約 40 年～ 700 年的開采量，全球能源安全正面臨著巨大的威脅，有限的資源迫使人類社會尋找可再生的能源，比如生物質(zhì)能源 [1]。 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 2 1 文獻綜述 纖維素酶研究意義 能源與環(huán)境問題將是人類在 21 世紀首要面臨的嚴峻問題，自英國經(jīng)歷了工業(yè)革命至今，人類社會迅猛發(fā)展，但是環(huán)境污染與能源短缺的問題也隨之而來了。 本課題將高產(chǎn)纖 維素酶的菌種 M20 優(yōu)化培養(yǎng)，其產(chǎn)生的纖維素酶用于木質(zhì)纖維素原料水解，得到了還原糖。最后分離篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株 M20，經(jīng)過鑒定為綠色木霉菌（ Trichoderma viride）。因此，找到一株能夠高產(chǎn)纖維素酶的菌種并且研究其產(chǎn)酶優(yōu)化條件是十分重要的。如果這些木質(zhì)纖維素原料可以被合理利用而不是當作垃圾處理，那么其產(chǎn)生的經(jīng)濟效益將是十分可觀的，甚至可以改變當今世界的能源結(jié)構(gòu)。所謂纖維素乙醇的生產(chǎn)，是以木質(zhì)纖維素為原料通過預(yù)處理、纖維素酶水解、酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇等的一系列生化反應(yīng)過程。石油燃燒所產(chǎn)生環(huán)境問題也變得日益嚴重，汽車在使用汽油或柴油作為動力的過程中，產(chǎn)生了大量的碳氧化物與氮氧化物，并且鉛等重金屬也以氣體的形態(tài)散逸到空氣中，這對環(huán)境與人類的健康產(chǎn)生了巨大威脅，汽車的生產(chǎn)與使用量正逐年增加，其所帶來的后果必將是更加嚴重 的環(huán)境污染。 lignocelluloses。 filter paper activity。 feed industry and biofuel production, therefore, development of efficient producer strains and cellulase production have attracted the attention of researchers worldwide. In this study, filamentous fungi and strepotmycete strains were isolated from corn stover post in Shanxi and marine sediment samples in Dalian, one of which showed superior cellulosic enzyme activity and was named M20. ITS sequence analysis showed that M20 showed the highest identity to that of Trichoderma viride. Fermentation broth of M20 exhibited good hydrolytic activities against not only filter paper, sodium carboxyl methyl cellulose, and cotton fiber, but also corn stover, lawn grass, fallen leaves, and Jerusalem artichoke stalk. The properties of the cellulosic enzymes were studied, and the cellulase production conditions were further optimized, the main results were listed below: The best elicitor of cellulase in M20 is microcrystalline cellulose, and the optimum final concentration is %. The best nitrogen source in replace of amino acid is peptone. At 28℃ and when the initial pH value was 6, Filter Paper Activity (FPA) reached IU/ml within 7 days. The optimum media position was obtained by orthogonal design, and the highest FPA attained IU / ml, with 12% increase paring with the control. The optimum pH for enzyme reaction was and the optimum temperature 50℃ . The activity of the cellulase did not change significantly at 50℃ within 2 weeks, while the enzyme activity was lowered significantly under the temperatures higher than 60℃ . Next, celluase production was tested in a 5L fermentor. The results showed that FPA reached the highest value of 8 IU / ml within 6 days. Optimum operation condition was proved to be first cultivating at pH , after days, changing the pH value to 6, and adding 5 g/L (final concentration) of microcrystalline cellulose on the 3rd day. Under this condition, the FPA reached the highest activity of 8 IU/ml in the 5th day. Hydrolysis of different lignocellulosic materials was carried out using the broth of M20, and the sugar release was investigated by HPLC. The results showed that corn stover contains highest amount of glucose and xylose, lawn grass released more glucose than Jerusalem 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 III artichoke stalks and fallen leaves. On the other hand, Jerusalem artichoke stalks released more xylose than fallen leaves and lawn grass. Key Words: Trichoderma viride。這些結(jié)果表明， M20 的發(fā)酵液可以水解不同來源的木質(zhì)纖維素原料。調(diào)控 pH 先為 ，生長 天以后，調(diào)控pH 為 6，并且在第三天一次性加入終濃度為 5g/L 的微晶纖維素，在發(fā)酵第 5 天 FPA 可以達到 8 IU/ml，達到最高酶活時間提前了一天。 M20 所產(chǎn)纖維素酶在低溫條件下保存 2 周酶活性變化不明顯，但對 60℃ 以上的高溫較為敏感，其 最佳酶反應(yīng)條件是：溫度 50℃ ， pH 為 。替代氨基酸的最佳氮源為蛋白胨，當初始 pH 為 6，培養(yǎng)溫度為 28℃ ，發(fā)酵培養(yǎng) 第 7 天 時，濾紙酶活力（ FPA）可以達到 IU/ml。 M20 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液具有降解纖維素的能力，對濾紙、羧甲基纖維素鈉等纖維素的水解能力較強，也可以降解玉米秸稈、草坪草、落葉、菊芋秸稈等木質(zhì)纖維素原料。 學(xué)位論文題目： 作 者 簽 名 ： 日期： 年 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 I 摘 要 纖維素酶在食品、飼料及生物能源生產(chǎn)等多個領(lǐng)域都有重要應(yīng)用，因此其生產(chǎn)菌的開發(fā)和發(fā)酵生產(chǎn)受到各國學(xué)者的重視。與我一同工作的同志對本研究所做的貢獻均已在論文中做了明確的說明并表示了謝意。 碩 士 學(xué) 位 論 文 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定 與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 Screening, characterization of efficient cellulase producer and optimization of cellulase production 作 者 姓 名： 孫 鴻 金 學(xué)科、 專業(yè)： 生物工程 學(xué) 號： 30918022 指 導(dǎo) 教 師： 趙心清 副教授 完 成 日 期： 2022 年 11 月 大連理工大學(xué) 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 II 大連理工大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明 作者鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進行研究工作 所取得的成果。盡我所知，除文中已經(jīng)注明引用內(nèi)容和致謝的地方外，本論文不包含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，也不包含其他已申請學(xué)位或其他用途使用過的成果。 若有不實之處，本人愿意承擔相關(guān)法律責任。本論文從山西玉米秸稈堆積處土壤和大連海泥樣品中分離得到 10 株具有纖維素水解活性的絲狀真菌和放線菌，其中一株木霉菌 M20 活性最好， ITS 序列分析結(jié)果表明，該菌種與綠色木霉（ Trichoderma viride）很相近， ITS序列最大相似度為 97%。 進一步研究了所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)，并優(yōu)化了 M20 的產(chǎn)纖維素酶條件 ，主要實驗結(jié)果如下： M20 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳誘導(dǎo)物為微晶纖維素，最佳添加量為 %。通過正交設(shè)計軟件設(shè)計培養(yǎng)基組分添加量方案，濾紙酶活力（ FPA） 最優(yōu)結(jié)果可以達到 IU/ml，比對照提高了 12%。 利用 5L 發(fā)酵罐培養(yǎng) M20 進行發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，結(jié)果表明，產(chǎn)纖維素酶的酶活在第 6天達到最高值， FPA 可以達到 8 IU/ml 左右。 用 M20 的發(fā)酵液可以水解不同的木質(zhì)纖維素原料，利用 HPLC 測定還原糖其釋放含量，結(jié)果表明，玉米秸稈釋放的葡萄糖與木糖含量最多，草坪草釋放的葡萄糖含量比菊芋秸稈多，而落葉最少，從水解釋放的木糖含量來看，菊芋秸稈要多于落葉，而草坪草最少。 關(guān)鍵詞： 綠色木霉菌 ；纖維素酶；濾紙酶活力；發(fā)酵優(yōu)化；木質(zhì)纖維素；還原糖 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 II Screening, characterization of efficient cellulase producer and optimization of cellulase production Abstract Cellulosic enzymes have important applications in various fields including food processing。 cellulase。 Optimization of fermentation conditions。 reducing sugar 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 IV 目 錄 摘 要 ..................................................................................................................................... I Abstract ..................................................................................................................................... II 引 言 ...................................................................................