【正文】 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 14 頁(yè) 圖 CMC酶活力測(cè)定顯色后所拍攝，圖中顏色最深的是編號(hào)為 BL5106的菌株 ， BL5106的 OD值為 。 將分離到的 13 株菌分別接種一環(huán)到裝有 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中， 30 176。 表 LB 菌懸液 OD 測(cè)定 菌株編號(hào) 0（ h）OD660nm 4（ h）OD660nm 8（ h）OD660nm 12（ h）OD660nm 16（ h）OD660nm 20（ h）OD660nm 24（ h）OD660nm 28（ h）OD660nm 32（ h）OD660nm 36（ h）OD660nm 40（ h）OD660nm BH19 BH314 BH331 BH520 BH526 BH536 BH634 BL345 BL465 BL5581 BL595 BL599 BL5106 注： 生長(zhǎng)曲線的繪制時(shí) 以細(xì)菌懸液的 吸光度 （ ） 為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo) 繪 出 。C 、 120 r /min 振蕩培養(yǎng) 下的菌種，其吸光度因顆粒分布不均，必然無法準(zhǔn)確測(cè)定。 30176。 做長(zhǎng)期保存則是 將菌種接種到斜邊保存基上， 4176。C 3d BL5106 30176。C 3d BL465 30176。C 3d BH526 50176。 表 初篩中 13株細(xì)菌 透明圈與菌落半徑比值 樣品編號(hào) 菌落半徑（ cm） 透明圈半徑 （ cm） 透明圈與菌落半徑比值 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時(shí)間 BH19 50176。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 11 頁(yè) 共選取 13 株菌進(jìn)行纖維素酶活力等測(cè)定 ， 圖 是初篩 時(shí)幾株透明圈較為明顯細(xì)菌。透明圈與菌落半徑比值超過 10 的有 12 株，透明圈與菌落半徑比值超過 5 的有 103 株。 細(xì)菌的純化一般采用二區(qū)劃線法，通過這種方式，進(jìn)一步分離所篩選的菌種。定義每分鐘催化纖維素水解生成 1 μg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位， 即 在 50176。C 恒溫水浴加熱，充分反應(yīng) 30 min。對(duì)每個(gè)樣品都設(shè)一個(gè)參照樣，先加 mL 蒸餾水，后加 mL 相應(yīng)樣品的粗酶液。若濾紙不到 2 4 h 全部分解，則記下達(dá)到全部被分解的時(shí)間，拍照 記錄。C 、 50176。CMC酶活力的測(cè)定：取 CMC 緩沖液 mL于比色皿中，加入 mL 稀釋 10 倍 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 9 頁(yè) 的酶液， 50176。 2． 粗酶液制備 將初篩選取的菌株環(huán)取一環(huán)接種到纖維素羧甲基鈉活化培養(yǎng)液中， 30176。 表 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的制備 管號(hào) 制備標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的濃度（ μg/mL） 加 500ug/ml 標(biāo)準(zhǔn)葡萄液（ mL） 加蒸餾水量（ mL） 0 0 0 10 1 40 2 80 3 120 4 160 5 200 4 6 6 240 加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，在試管中分別加入 mL DNS 試劑，于沸水浴中加熱 5 min 進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水 mL，搖勻，用 721G 可見分光光度計(jì)，在 520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定 吸光度 。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 8 頁(yè) 纖維素分解細(xì)菌的復(fù)篩 1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 7支 10 mL試管，編號(hào)，按表 （ 500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。每 4 h取樣一次通 過分光光度法測(cè)定菌體濃度 。根據(jù)透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續(xù)進(jìn)行研究。 細(xì)菌初篩 將純化的菌株接種到 纖維素鈉 (CMCNa)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基的上 ， 每個(gè)培養(yǎng)基點(diǎn) 2 個(gè)樣， 不同處理均作 3 個(gè)重復(fù)。C 及 50176。 6．濾紙紙 1 %醋酸浸泡 24 h，用碘液檢驗(yàn)確定無淀粉后。 3．醋酸緩沖液 (pH )：取 g 冰醋酸鈉溶于 mL 蒸餾水中，用冰醋酸將該溶液的 pH 值調(diào)至 （ 約用 l2 mL） ，用蒸餾水定容至 mL。 主要試劑和儀器 試劑 1． DNS 試劑 甲液：溶解 6. 9 g結(jié)晶酚于 15. 2 mL、 10 % NaOH 溶液中， 并用水稀釋至 69 mL， 在此溶液中加 6. 9 g NaHSO3. 乙液： 稱取 255 g 酒石酸鉀鈉加到 mL、 1 0 % NaOH 溶液中， 再加入 mL、 1 % 3， 5二硝基水楊酸溶液 .將甲、乙二液相混合即得黃色試劑， 貯存于綜色 冰箱低溫保藏 1 周后使用。3H2O g、 KH2PO4 g、 NH4NO3 g、 FeCl33H2O g、 MgSO4 3． LB 培養(yǎng)基 [14]： 蛋白胨 g、 NaCl g、酵母膏 g、蒸餾水 ml、調(diào) pH 。進(jìn)行一定的不同碳氮源、溫度、 pH 條件下的初略比較， 為下階段研究做準(zhǔn)備； 技術(shù)路線圖 酒糟、酒曲、酒醅、廢舊稻草、土壤樣品的采集制備保存 樣品 30℃下細(xì)菌分離培養(yǎng) 50℃下細(xì)菌分離培養(yǎng) 相關(guān)準(zhǔn)備工作 30℃、 50℃下預(yù)備試驗(yàn) 從樣品中分離、純化細(xì)菌 通過透明圈大小、濾紙潰爛度 初篩出具有分解纖維素的細(xì)菌菌株 對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定 進(jìn)行濾紙、羧甲基纖維素鈉酶活測(cè)定 鑒定命名保存篩選出的目標(biāo)菌落 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第 5 頁(yè) 培養(yǎng)基 1．牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 [14]：牛肉膏 g、蛋白胨 g、瓊脂 ~ g、 NaCl g、蒸餾水 mL，調(diào) pH 。C 及 50176。C 條件下保存。C ，年日照時(shí)數(shù) 1400 h，無霜期 311 d，年降雨量800— 1000 mL。 在纖維素利用的研究中， 研究的對(duì)象多偏重于厭氧高溫纖維素分解菌，好氧高溫纖維素分解菌涉及較少；研究?jī)?nèi)容多偏重于分類學(xué)方面以及菌株在厭氧發(fā)酵纖維素類物質(zhì)方面的應(yīng)用。對(duì)酒糟發(fā)酵減重最高達(dá) 18%。 國(guó)內(nèi)外研究概況 在關(guān)于纖維素酶 活性及發(fā)酵時(shí)間、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響研究方面，江龍法等 [12]從白酒糟采集的樣品中初篩得到產(chǎn)纖維素酶酶活較高的 5 株菌。好氧細(xì)菌以可溶性胞外酶的形式分泌出 3種纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行水解， 如纖維桿菌屬 (Culmolnoas)的纖維單胞菌。 纖維素分解細(xì)菌的簡(jiǎn)介 能產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌種類雖不如真菌， 生孢食纖維菌屬 ( Sporocytophaga ) 、有報(bào)道的食纖維菌 ( Cytophaga) 、 多囊纖維菌屬 ( Polyangiumcellulosum) 等屬細(xì)菌均有較強(qiáng)分解纖維素的能力 [6] 。纖維素酶的比活力一般都很低，因而產(chǎn)酶成本高。 關(guān)鍵詞： 纖維素分解細(xì)菌， 酶活性 ，纖維素酶，篩選 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） III Screening of Vinasse Cellulose Deposing Bacteria and Research on Enzyme Production ABSTRAC T 244 bacteria strains which could form a sharp and distinct zone around the cellulaseproducing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Gram’ s iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than , and among which, the radius ratio was more than were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL595 was the highest (). The strain number which the radius of distinct zone was more than cm under 30℃ and more than cm under 50℃ conditions was 20. In this study, 7 strains from 50℃ conditions and 6 strains from 30℃ conditions had been chosen to assay the active of cellulases and other index. The growth curve of strains test were cultured under 30℃ static culture and 50℃ oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions. However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50℃