【正文】 穩(wěn)定晶型需要足夠的時間 ， 延長結(jié)晶時間有利于穩(wěn)定晶型的形成和成長。脫脂效果主要取決于晶粒的數(shù)量與大小 ， 在冷凍脫脂過程中晶核的生成及晶粒的生長速率與冷卻速率有著極大的相關性。一是結(jié)晶溫度和冷卻速率。固體脂的結(jié)晶可分為 3 個階段 ： 一是油脂的冷卻、過飽和 ； 二是晶核的形成 ； 三是脂晶的成長。該方法成本較低 ， 吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣 ， 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛 [20]。應用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學特性 ， 以便設計出最好的分離條件。 (4)利用對配體的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力 (即生物學親和力 )建立起來的一種有效的純化 方法。李全宏等 [18]將離子交換層析應用于濃縮蘋果汁中蛋白質(zhì)的提純。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負電荷的蛋白質(zhì) ， 被留在層析柱上 ， 通過提高洗脫液中的鹽濃度 ， 將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來 ， 其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。離子交換層析中 ， 基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ， 聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低 ， 加樣量不高 ； 等電 聚焦電泳分辨率最高 ， 可以分離同種蛋白的亞成分 ， 加樣量最小 ； 等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高 ， 可將樣品分成單一成分 ， 加樣量最大。在外電場作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點的 pH 值梯度處形成一個窄條帶。等電聚焦是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術 ， 也可以用于蛋白質(zhì)的等電點測定。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳 ， 常用于分離蛋白質(zhì)。 (3)根據(jù)電荷不同進行分離純化 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。這種方法的優(yōu)點是萃取過程中蛋白質(zhì)因位于反膠團的內(nèi)部而受到反膠團的保護。 反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質(zhì)包裹其中而達到提取蛋白質(zhì)的目的。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮 ， 細胞碎片等固體物分布在下相中。此方法可以在室溫環(huán)境下進行 ， 雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 ， 收率較高。 萃取是分離和提純有機化合物常 用的一種方法 ， 而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質(zhì)。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由 Cohn 于 1949 年提出 ，用于制備丙種球蛋白。因 此 ， 通常要將有機溶劑冷卻 ， 然后在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高 ， 蛋白質(zhì)變性問題就可以很大程度上得到解決。例如 ， 在冰浴中磁力攪拌下 ， 在 4℃ 預冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇 (25℃ )， 可以使冰核蛋白析出 ， 從而純化冰核蛋白。利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進行提純后 ， 通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽。由于硫酸銨在水中呈酸性 ， 為防止其對蛋白10 質(zhì)的破壞 ， 應用氨水調(diào) pH 值至中性。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質(zhì) ， 其最佳提取工藝是 ： 以 10%NaCl 溶液 ， 按 1∶ 25 的料液比 ， 在 30℃ 攪拌提取 30min， 蛋白質(zhì)提取率為 %。 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象 ， 其中 ， 增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶 ， 反之為鹽析。另外還可以利用堿法提取大米蛋白 ， 其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取。李鳳英等測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點為 。李殿寶在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的 pH 值調(diào)到 3～ 4， 使目標蛋白于等電點沉淀出來。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的 pH 值來分離純化蛋白質(zhì)。 等電點沉淀和 pH 值調(diào)節(jié)是最常用的方法。但在同一條件下 ， 不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度 ， 根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點 ， 適當?shù)馗淖兺獠織l件 ， 就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度 ， 達到分離純化蛋白質(zhì)的目的。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。 凝膠過濾也稱凝膠滲透層析 ， 是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白 ， 得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。例如 ， 在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實驗中 ， 加入纖維素酶和 ? 淀粉酶進行預處理后 ， 再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進行初步分離 [13]。 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。由于超濾過程中 ， 濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞 ，以致超濾速度減慢 ， 截流物質(zhì)的分子量也越來越小。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機鹽為主的小分子分開。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中 ， 再浸入透析液進行分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。 8 天然產(chǎn)物 提取液的精制 方法 隨著科技的發(fā)展和生活水平的提高 ， 天然產(chǎn)物 以其健康、安全的特點，將越來越受人們的歡迎， 但 天然產(chǎn)物大多不能直接使用，而 只需要其中的某些 物質(zhì)，因此需要對天然產(chǎn)物進行提取分離，提取后所得提取液大多數(shù)是混合物，需 利用體系中各組分物性的差別，使用 不同的方法使混合物得到分離提純。只要我們能把自己的天然色素做到標準化、系列化、實用化 ， 一定能培養(yǎng)出中國這個大市場 ，這已經(jīng)為火腿腸使用紅曲紅和餅干噴涂辣椒紅的中國市場所證明。我國是一個占世界人口四分之一的、具有 13 億人口的大國 ， 因此 ， 這樣多的人口 ， 要進 入 一日三餐的加工食品時代 ， 需要的食用天然色素是很大的。這種綜合利用的開發(fā) ， 可以大大提高經(jīng)濟效益。辣椒的種子可以提取辣椒堿及辣椒油 ， 殘渣含高蛋白 ； 辣椒種皮可以提取辣椒紅色素、辣椒堿 ， 殘渣再配上面醬、油、鮮味劑 ， 可精制辣醬。用高粱殼生產(chǎn)高粱紅 ； 用葡萄皮渣生產(chǎn)葡 萄色素等 ， 原料低廉。許多天然色素生產(chǎn)的原料是野生植物、農(nóng)作物副產(chǎn)品或廢棄物。 (4)進行原料的綜合利用 在原料上應當走綜合利用 ， 變廢 為寶的道路。我們應當奮進直追 ， 迎頭趕上。就某一個天然色素而言 ， 一個企業(yè)也沒有完全做到標準化、系列化 ， 缺欠實用技術的開發(fā)。我國各天然色素生產(chǎn)企業(yè)一般規(guī)模都偏小 ， 產(chǎn)品單一 ， 在小量、低質(zhì)量、高損耗中徘徊 ， 經(jīng)濟效益不明顯 ， 抗風險能力 差。 (3)實現(xiàn)產(chǎn)品的標準化、系列化、實用化 ， 開拓國內(nèi)外市場。在天然 色素 的生產(chǎn)過程中 ， 可以采用的高新技術有 ： 基因工程、細胞工程、發(fā) 酵工程、吸附色譜、凝膠過濾、微孔過濾、超濾、電滲析、反滲透、膜分離技術、超臨界流體萃取分離技術 ( 2CO 、 丙烷 )、冷凍干燥等技術。 (2)提高技術與裝備水平 ， 促進天然色素 的生產(chǎn) 天 然 色素 的生產(chǎn)應當采用高新技術 ， 不斷提高裝備水平 ， 提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量 ， 降低成本 ， 從而提高產(chǎn)品在國內(nèi)外市場的競爭力。紅曲米中含有降血脂物質(zhì)酪伐它汀 ， 作為著色劑用于食品中 ，可以有效地使人體內(nèi)血脂達到正常平 衡不少以類黃酮為天 然色素的物質(zhì)有抗氧化功能或軟化血管功能。隨著人民生活水平的提高和食品工業(yè)不斷發(fā)展與壯大 ， 食用色素發(fā)展在我國具有廣闊的前景 ，以天然色素為例說明我國對天然 產(chǎn)物發(fā)展的政策方針。特別是一些農(nóng)產(chǎn)品 ， 如玉米、高粱、辣椒、蘿卜等更是隨處可見 ， 這就為天然 產(chǎn)物 的開發(fā)利用提供了豐富的原料 ， 也為農(nóng)副產(chǎn)品的深加工開辟了新的途徑。 同時由于人們對化學合成色素危害性認知的增加， 天然產(chǎn)物 具有的天然和健康屬性 ， 使天然 色素 的種類和市場需求量大幅度增加 ， 而且色素品種逐漸由合成色素轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊簧?， 但目前天然色素的開發(fā)生產(chǎn)遠6 不能滿足現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展的需要 ， 開發(fā)新品種的天然色素 ， 探索新的天然色素來源 ， 對原有天然色素的生產(chǎn)工藝進行改進 ， 擴大天然色素的應用范圍 ， 降低天然色素的生產(chǎn)成本 ， 已成為添加劑行業(yè)和研究者們非常迫切的問題。 天然 產(chǎn)物 的 發(fā)展前景 隨著我國食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)的發(fā)展 ， 天然 產(chǎn)物 的市場需求量將大幅度增加 ， 新產(chǎn)品開發(fā)和應用范圍的擴大 ， 使得天然產(chǎn)物 市場具有廣闊的發(fā)展前景。在 人們崇尚綠色天然食品的今天 ， 用純化學 物質(zhì)人工合成的食品著色劑和食用色素已不占食用色素市場的主流。這些食品天然色素產(chǎn)品除在國內(nèi)銷售外 ， 還遠銷國外。據(jù) 1998 年下半年統(tǒng)計 ， 我國食用色素的年產(chǎn)量約 萬 噸 。經(jīng)過 20 多年的努力 ， 我國的食用色素產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模 ， 成為食品工業(yè)中的一個重要行業(yè)。我國還有一支龐大的天然色素研究開發(fā)隊伍。 目前已經(jīng)開發(fā)出 80 余種不同原料來源的食用天然色素。 我國天然 產(chǎn)物 的 應用現(xiàn)狀 我國疆域遼闊 ， 有著天然 產(chǎn)物 生產(chǎn)所需的豐富植物資源 ， 在發(fā)展天然 產(chǎn)物 方面具有一定的優(yōu)勢。在色素分離中 ， 利用色素與雜質(zhì)分子大小的差異 ， 5 采用纖維超濾膜和反滲透膜 ， 可阻留各種不溶性大分子如多糖、蛋白質(zhì)等。應用酶促反應還可改變天 然梔子黃色素中的梔子苷的結(jié)構(gòu) ， 生產(chǎn)出梔子紅、藍色素。 (8)酶法提取法 纖維素酶可使纖維素、半纖維素等物質(zhì)降解 ， 引起細胞壁和細胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生局部疏松、膨脹等變化 ， 從而增大胞內(nèi)有效成分向提取介質(zhì)的擴散 ， 促進 天然產(chǎn)物 提取效率的提高。對于熱不穩(wěn)定性或極性大的天然 產(chǎn)物 來說 ， HPLC 是一種有效的分離分析方法。 (7)高效液相色譜 (HPLC) 技術 HPLC 是一種以液體為流動相的現(xiàn)代柱色譜分離分析技術。其基本原理是利用被提取物質(zhì)在不同的兩相系統(tǒng)間分配行為的差異進行分離。結(jié)果表明 ， 采用分子蒸餾法 ，從脫蠟的甜橙油中一步提取的色素 ， 不含有機溶劑 ， 純度高 ， 色價高。該技術具有蒸餾溫度低 ， 蒸餾壓力低 ， 分離程度高 ， 受熱時間短等特點 ， 因而能大大降低高沸點物料的分離成本 ， 極好地保護熱敏性物料的品質(zhì) ， 真正保持了純天然的特性。微波萃取克服了超臨界萃取和溶劑萃取方法的上述缺陷 ， 既降低了操作費用 ， 又符合環(huán)境4 保護的要求 ， 表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景和巨大的應用潛力。宿樹蘭等采用 正交試驗優(yōu)化超臨界流體萃取姜黃藥材中姜黃素 ， 得到姜黃素占萃取物量高達 %。由于超臨界 2CO 提取工藝簡單 ， 能耗低 ， 萃取劑便宜 ， 提取的產(chǎn)品具有純度高 ， 溶劑殘留少 ， 無毒副作用等優(yōu)點 ， 越來越受到人們的重視。 (3)超臨界 2CO 流體萃取法 超臨界二氧化碳流體萃取是近二十年發(fā)展起來的一種新型物質(zhì)分離、精制技術。辣椒紅色素的堿提取是以 15% 40%的 NaOH 水溶液處理辣椒油樹脂 ，使辣椒紅色素中的脂肪成分發(fā)生皂化反應 ， 從而將辣椒紅色素游離釋放出來 ， 再分離精制可得到產(chǎn)品。 (2)堿提取法 堿提法主要是應用堿對多種生物物質(zhì)的影響作用 ， 其提取效率雖不 如有機溶劑提取率高 ， 但從經(jīng)濟角度和安全性考慮仍有應用價值。利用有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取姜黃得姜黃色素 [7]， 將蝦殼用鹽酸浸泡 24h 后過濾 ， 濾渣用 95%乙醇浸泡提取液經(jīng)蒸餾后得到濃縮的粗制蝦青素提取物。 3 (1)有機溶劑提取法 溶劑提取法是目前從動植物中提取色素的一種常用的方法。通過對 天然產(chǎn)物 分子性質(zhì)的研究 ， 人們就可以更好地指導其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用 ， 為 天然產(chǎn)物 工業(yè)的發(fā)展提供理論基礎。近年來隨著生物技術的發(fā)展 ， 利用生物技術生產(chǎn)天然 產(chǎn)物 已為人們開闊了廣泛的領域 ， 如 利用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)藍色素、紅曲色素等多種天然色素已成為現(xiàn)實 [34]， 利用微生物具有 特定 的 優(yōu)勢 ， 如不受資源、環(huán)境和空間的限制 ， 以及生長迅速等 ， 可快速大量的生產(chǎn)天然 產(chǎn)物 。目前絕大多數(shù)品種的天然 產(chǎn)物