【年會(huì)報(bào)告】-xxxx生物教育年會(huì)報(bào)告基因工程與細(xì)胞工程-文庫吧資料
2025-02-09 17:04本頁面
【正文】 成串，形成細(xì)胞間的緊密接觸；然后在高強(qiáng)度的直流電脈沖作用下，相互連接的細(xì)胞質(zhì)膜被擊穿而導(dǎo)致細(xì)胞融合。其缺點(diǎn)是操作過程繁瑣， PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。二、聚乙二醇（ PEG）法n PEG分子式： HOH2C（ CH20CH2） nCH2OH，通常選用平均相對(duì)分子質(zhì)量為 1000～ 4000、濃度在 30%～ 50%的PEG進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的誘導(dǎo)融合。 Western雜交結(jié)果圖常見載體容量載體 質(zhì)粒 λ噬菌體黏粒 細(xì)菌人工染色體（BAC）酵母人工染色體（YAC）容量（ kb)10 23 45 350 1000（二）細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合（ cell fusion)， 又稱體細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合，形成單個(gè)細(xì)胞的過程。 Western雜交過程n ⑴ 經(jīng)過 SDSPAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜）上；n ⑵ 以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)；n ⑶ 再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的目的蛋白。其基本原理是通過 特異性抗體 對(duì)凝膠電泳分離的細(xì)胞或生物組織 蛋白樣品 進(jìn)行檢測(cè)。 ④ Northern雜交： 通過顯影檢查目的 DNA所在的位置。 Northern雜交 (檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA）Northern雜交的過程 ① 提取總 RNA ② 分離 mRNA： 利用親和層析的原理純化 mRNA。 放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移 探針雜交－＋ 提取分離受體細(xì)胞的提取分離受體細(xì)胞的 mRNA,將將 mRNA分子分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。n (4) 讓探針與同源 DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 n (2) 將 DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物 (硝酸纖維素濾膜或尼龍膜 )上。 分子雜交的方法 通常是采用各種方法將核酸（蛋白質(zhì)）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等標(biāo)記的探針（抗體）與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影（顯色）后顯示出目的核酸（蛋白質(zhì)）分子。n 分子雜交：采用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子。n 磷酸二酯法n 亞磷酸三酯法獲取目的基因的方法n一般來說：n 目的基因的獲得通常采用 PCR法；化學(xué)合成法由于合成的片段較短，一般用于引物和探針的合成；基因文庫一般用于保存基因資源。n PCR法獲取目的基因的 前提是： 要有足夠制備合適引物的信息PCR法獲取目的基因優(yōu)點(diǎn)n ：在有足夠引物信息的情況下，可直接從基因組 DNA中克隆目的基因，大大減少了基因分離的工作量；n ：可從極微量的模板擴(kuò)增出目的片段；n ：由于其靈敏度高和特異性強(qiáng)，極微量的材料或者混合的組織、部分已降解的 DNA材料都可以作為起始材料；化學(xué)合成制備目的基因n 如果蛋白分子較小，可根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出其基因序列，采用人工合成的方法制備目的基因。特點(diǎn)：免疫篩選法（一）放射性抗體檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+免疫沉淀檢測(cè)法菌落沉淀素免疫篩選法（二）PCR法獲取目的基因已知基因：n 設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，直接從基因組 DNA中擴(kuò)增該目的基因。核酸雜交（ 菌落原位雜交法 ）n 直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 ,經(jīng)溶菌和變性處理后使 DNA暴露
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