暑假中學骨干生物教師培訓基因工程和細胞工程-文庫吧資料
2025-01-24 01:40本頁面
【正文】 ? (3) 預雜交濾膜 ,掩蓋濾膜上非特異性位點。 Southern雜交的操作步驟 ? (1) 酶切 DNA，凝膠電泳分離各酶切片段 ,然后使 DNA原位變性。 ? 蛋白質之間的雜交通過抗原抗體反應進行。 ? 分子雜交可在 DNA與 DNA、 RNA與 RNA或 RNA與DNA的二條單鏈之間進行，也可以在蛋白質與蛋白質之間進行。 ? 分子雜交：采用已知標記的核酸分子或蛋白質分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質分子。 化學合成制備目的基因 ? 磷酸二酯法 ? 亞磷酸三酯法 獲取目的基因的方法 ? 一般來說： ? 目的基因的獲得通常采用 PCR法；化學合成法由于合成的片段較短，一般用于引物和探針的合成；基因文庫一般用于保存基因資源。 未知基因： ? 參照其他物種中該基因的兩末端設計引物，從基因組 DNA（或文庫）中擴增該目的基因； ? 依照其他物種中該基因的保守區(qū)段序列設計引物，擴增出一段 DNA，標記為探針，從基因組文庫、cDNA文庫中釣出該基因。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定的 未知基因 非常困難，因此 先把材料 DNA分成若干易于處理的片段，然后確定目標序列在哪一片段，再進一步從該片段尋找目標序列，事情就變得容易了。 特點： PCR篩選法 利用合適的引物 ， 以從初選出來的陽性克隆中提出的質粒為模板進行 PCR， 通過對PCR產物的電泳分析 ， 確定目的基因序列所在克隆 。 菌落原位雜交法（核酸雜交） ? 直接把菌落印跡轉移到硝酸纖維素濾膜上 ,經溶菌和變性處理后使 DNA暴露出來并與濾膜原位結合 ,再與特異性 DNA探針雜交 ,篩選出含有目的序列的菌落。 ? 最初是使用帶放射性的 DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。 cDNA克隆的主要的缺點 ? cDNA文庫所包含的遺傳信息遠少于基因組 DNA文庫，并且受細胞來源或發(fā)育時期的影響； ? cDNA文庫不能直接獲得基因內含子序列和基因編碼區(qū)外大量調控序列的結構與功能方面信息； ? 在 cDNA文庫中，高豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而低豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 基因組文庫的質量標準 一個理想的基因組文庫應具備下列條件： ? 重組克隆的總數(shù)不宜過大 ，以減輕篩選工作的壓力； ? 載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆； ? 克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序； ? 克隆片段易于從載體分子上完整卸下； ? 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。 結構基因 外顯子 內含子 轉錄、加工修飾 mRNA cDNA文庫 反轉錄酶 cDNA 克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定 構建基因文庫的基本程序 1)提取研究對象基因組 DNA，制備合適大小的 DNA片段，或提取組織或器官的 mRNA并反轉錄成 cDNA； 2) DNA片段或 cDNA片段與經特殊處理的 載體 連接形成重組 DNA； 3)重組 DNA轉化 宿主細胞 或體外包裝后侵染受體菌； 4)陽性重組菌落或噬菌斑的篩選。 基因組文庫 cDNA文庫 (cDNA library) ? 提取某生物組織或發(fā)育時期的總 mRNA
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