【正文】 并測定其分子長度是一種直截了當的方法 通常用比較簡單的凝膠電泳進行檢測。在實驗時，擴增操作往往與轉化操作偶聯在一起，如： Ca2+誘導轉化后的 37℃ 培養(yǎng)一個小時 原生質體轉化后的再生過程 λ噬菌體轉染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴增操作 基因工程－－第四章 基因操作過程 第三節(jié) 重組子的篩選 “ 選擇”（ selection）和“篩選”（ screening）的基本含義 選擇： 是指通過某種外來附加壓力（或因素）的辨別作用，呈現具有重組 DNA分子的特定克隆類型的一種方法 篩選 ：是指通過某種特定的方法，從被分析的細胞群體或基因文庫中，鑒定出真正具有所需要重組 DNA分子的特定克隆的過程 簡單選擇 ： 根據克隆載體提供的表型特征的 選擇 直接選擇： 根據突變的互補作用對克隆基因的選擇 基因工程－－第四章 基因操作過程 由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉化子 與非轉化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 物理檢測法 核酸雜交法 免疫化學法 遺傳檢測法 重組子的篩選方法主要有 DNA測序檢測法 基因工程－－第四章 基因操作過程 1 遺傳檢測法 插入失活選擇法 （ Tetr等 ) 顯色互補選擇法（ LacZ′） 抗藥性標記 (Ampr、 Tetr等 ) 插入表達選擇法 （ CⅠ 阻礙蛋白失活， CⅠ 表達） 利用報告基因選擇法（ GUS、 Gfp、 NTPⅡ 、 LUC、 TK等） 根據選擇性標記篩選轉化子 基因工程－－第四章 基因操作過程 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r 抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗藥性篩選法可區(qū)分轉化子與非 轉化子、重組子與非重組子 將外源 DNA片段插在 EcoRI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs 基因工程－－第四章 基因操作過程 抗藥性篩選法 抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉化液涂布含有 Amp的平板 再將 Amp平板上的轉化子影印至 含有 Amp和 Tet的平板上 在 Ap平板上生長、但在 Ap和 Tc 平板上 不長的轉化子即為 Ap Ap + Tc 影印 挑選 重組子 基因工程－－第四章 基因操作過程 顯色篩選法 顯色篩選法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ39。 在強大電場的作用下 ， 細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙 ， 質?；?DNA重組分子便可進入細胞內 電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質粒消除實驗 基因工程－－第四章 基因操作過程 將細菌溶于 1～ 2ml 10%的甘油中，以 40～ 80μl/管分裝 70℃ 凍存，備用 挑一個 DH10B的單菌落接種于 5ml 液體 LB中，過夜培養(yǎng) 1/100 接種后 37℃ ， 220轉 /min，搖菌 2～３ h(OD500達 ) 6000rpm,4℃ 離心 15min,收集菌體，以下均需在冰上操作 用等體積的滅菌去離子水徹底洗細菌沉淀，離心收集 用 1/2 的滅菌去離子水徹底洗細菌沉淀，離心收集 加入 20～ 30ml 10%的滅菌甘油洗細菌沉淀，離心收集 基因工程－－第四章 基因操作過程 將脈沖電擊轉化儀打開，調電壓為 從 70℃ 取出保存的感受態(tài)細胞，解凍后置于冰上 每管感受態(tài)細胞加入 1μl 連接產物 ,轉移到電擊杯中 電擊，然后迅速向電擊杯中加入 1ml液體 LB培養(yǎng)基 將電擊后的菌液轉移至 Eppendorf管， 37℃ 恒溫搖床培養(yǎng) 1h 鋪 100μl于含 Xgal和 IPTG的 Amp平板 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 9－ 16h 基因工程－－第四章 基因操作過程 2510電轉儀，適用于原核細胞 適用于真核細胞電轉化及原生質體融合 基因工程－－第四章 基因操作過程 In vitro packaging and transfection 轉染（ transfection） 基因工程－－第四章 基因操作過程 l噬菌體 DNA的轉染 感受態(tài)細胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經體外包裝好的重組噬菌體懸浮液 ， 30℃ 保溫 10分鐘 轉染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃ 培養(yǎng) 2小時，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選 基因工程－－第四章 基因操作過程 3 轉化率 轉化率是衡量轉化效率的重要指標 轉化率 ：每微克載體 DNA在最佳轉化條件下進入受體細胞的分子數 在一般的轉化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉化率的定義也可以表征為： 每微克載體 DNA轉化后，受體細胞接納 DNA的個數，即克隆數（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長） 基因工程－－第四章 基因操作過程 如： pUC18對大腸桿菌的轉化率為 108，即每微克 pUC18中只有 108個分子能進入受體細胞。 也可加入總體積 15％的甘油 可－ 70℃ 長期保存 感受態(tài)細胞制備 : 將培養(yǎng)液轉入 ，在冰上放置 15－ 30min 4℃ 4000rpm離心 5min，棄上清 加入 ，懸浮沉淀，冰上預冷 10min 4000rpm離心 5 min，棄上清 基因工程－－第四章 基因操作過程 外源 DNA的轉化 取目的 DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，于冰上放置 30min 42℃ 水浴 90S （切勿搖晃?。? 冰上放置 2min 加入 800μl LB液體培養(yǎng)基 37℃ 水浴復蘇 50 min 基因工程－－第四章 基因操作過程 37℃ 培養(yǎng) 9～ 16h 鋪 200μl于含 Xgal， IPTG， Amp的 LB平板 （含 100μg/mL Amp，表面均勻涂有 16μL 50mg/mL的 Xgal和 4μL 200mg/mL的 IPTG混合液） 基因工程－－第四章 基因操作過程 利用成品感受態(tài)細菌轉化 基因工程－－第四章 基因操作過程 在 Selektionsplatten (LB/Amp/IPTG/XGal) 上生長的是轉化子 非重組子 重組子 基因工程－－第四章 基因操作過程 同時做兩個對照 : 以同體積的無菌雙蒸水代替重組質粒 DNA溶液 ,其它操作與上面相同。 微注射法： 將外源基因直接注射到真核受體細胞內轉化酵母菌 植物細胞的 葉盤法基因轉移 2 重組 DNA導入受體細胞的方法 基因工程－－第四章 基因操作過程 轉化（ transformation） 感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達質粒載體 DNA分子的生命過程 Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如 ） ① Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化 1970年建立此技術，原理是 Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現空隙， 細菌細胞處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)叫做 感受態(tài) (petent) 轉化子（ transforment） ： 導入外源 DNA后獲得了新的遺傳標志的細菌細胞或其它受體細胞。 但方法較繁，需要 λ核酸外切酶、 S1核酶、末端轉移酶等協(xié)同作用 基因工程－－第四章 基因操作過程 人工粘性末端的連接 5′突出末端 基因工程－－第四章 基因操作過程 人工粘性末端的連接 3′突出末端 基因工程－－第四章 基因操作過程 人工粘性末端的連接 平頭末端 基因工程－－第四章 基因操作過程 同聚物接尾法實際上是一種人工粘性末端連接法 主要優(yōu)點 不易自身環(huán)化 連接效率較高 同一種 DNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化 載體和外源片段的末端是互補的粘性末端 是一種通用的體外重組的方法 用任何一種方法制備的 DNA都可以用這種方法進行連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 5 重組率 重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數 / 載體分子總數 在常規(guī)實驗條件下 ， 重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應效率的重要指標 ， 較高的重組率可以 大大簡化 DNA重組的后續(xù)操作 。 基因工程－－第四章 基因操作過程 粘性末端的更換 基因工程－－第四章 基因操作過程 4 同聚物加尾 (homopolymer tails joining)連接法 同聚物加尾連接： 利用末端轉移酶在載體及外源雙鏈 DNA的 3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源 DNA和載體 DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸 dA(dG)和 dT(dC), 然后在 DNA連接酶的作用下 , 連接成為重組的 DNA。第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 轉化子的篩選和鑒定（ 檢 ） 重組 DNA分子的轉化和擴增（ 轉、增 ） DNA的體外重組 （ 切、接 ） 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 第一節(jié) DNA的體外重組 DNA的體外重組 ： 將目的 DNA、載體 DNA在 DNA連接酶的作用下，在體外進行分子連接（重組）過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 亞克隆 ： 把 DNA片段從某一類型的載體無性克隆繁殖支另一類型的載體的過程。 基因工程－－第四章 基因操作過程 理想的酶切位點應當符合下列幾個條件 位于載體上的酶切位點要盡可能少，最好是單一的酶切位點 酶切位點前方要一個較強的啟動子 選擇的載體必須在連接后對基因轉錄和翻譯過程中的編碼區(qū)讀框不改變 基因工程－－第四章 基因操作過程 外源 DNA與載體的連接方法 黏性末端連接法 平未端連接法 人工接頭連接法 同聚物加尾連接法 基因工程－－第四章 基因操作過程 1 黏性末端連接法 單酶切位點黏性末端連接法 基因工程－－第四章 基因操作過程 同種內切酶生產的粘性末端的連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 同尾酶生產的粘性末端的連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 單酶切位點黏性末端連接法的缺點 自身環(huán)化 雙向插入 多拷貝插入 假陽性 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙酶切片段的定向克隆 外源 DNA和載體 DNA經過兩個限制性內切酶切割后為非同源互補的黏性末端連接 外源 DNA和載體 DNA經過兩個限制性內切酶切割后一側產生的黏性末端，另一側產生平未端（可先生成黏性末端再補平） 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點 外源 DNA只能以一個方向定向插入到重組質粒中，以便目的基因的正確轉錄和表達 載體與外源 DNA結合處的限制酶切位點仍然保留，可以隨時從重組載體中通過相應的限制性內切酶切割后分離獲得目的基因 不會自身環(huán)化，轉化率高，轉化后的細菌克隆大多數攜帶有目的基因的重組質粒 基因工程－－第四章 基因操作過程 不同粘性末端的連接 2 平末端的連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多 提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 加入 10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用 加入單價陽離子（ NaC