第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備-文庫吧資料
2024-10-19 11:32本頁面
【正文】 蛋白質(zhì)的提純 小分子抗體的應(yīng)用 抗體融合蛋白的應(yīng)用 雙特異抗體的應(yīng)用 抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景 病原微生物抗原、抗體的檢測 腫瘤抗原的檢測 免疫細胞及其亞群的的檢測 激素測定 細胞因子的測定 一、檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑 病原體測定： 肝炎病毒－ HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－ 弓形蟲 ,風(fēng)疹病毒 ,巨細胞病毒 ，單純皰疹病毒 細胞表面 CD測定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的測定： 內(nèi)分泌疾病的診斷 藥物測定 (TDM)： 抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛 研究工作中的探針： 越來越多未知功能 cDNA的克隆 對復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加 免疫沉淀 二、蛋白質(zhì)的提純 單克隆抗體是親和層析中重要的配體。噬菌體抗體庫載體有 λ 噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達的噬菌體抗體庫 (surface display antibody library)常用載體； ④ 表達載體轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建全套抗體庫。 使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。 基因工程 BsAb 定義： 將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。多倍雜交瘤細胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費時費力，臨床應(yīng)用時存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng) (HAMA)，因此不適用于臨床。 但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。此法缺點是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應(yīng)細胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細胞更容易與腫瘤細胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。 免疫熒光法 鹽析沉淀 親和層析 離子交換層析 McAb的純化 Ig類型、亞類測定： 雙擴法或 ELISA法 特異性測定： 抗原類似物的交叉反應(yīng) 效價測定： 用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示 表位測定： 幾株單抗是否為不同表位特異的 ,用競 爭抑制法，相加指數(shù)法及微機集群分析 親和性測定： 測定親和常數(shù) K 雜交瘤細胞染色體： 秋水仙素裂解法，小鼠 B細胞染色體40條， SP2/0細胞 68條，雜交瘤細胞一般 100多條 McAb靶抗原分子量： 常用 western blot 三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性 高度特異性 高度的均一性和可重復(fù)性 弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng) 對環(huán)境敏感性 （一）單克隆抗體的特性 優(yōu)點 ： 在體外 “ 永久 ” 地存活并傳代 用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。短命 (7天 ) 雜交 瘤細胞 :HGPRT+ ， TK+。融合后 7天，換用 HT培養(yǎng)液 細胞融合 10～ 20天出現(xiàn)克隆 HAT篩選 挑克隆 融合細胞的早期培養(yǎng) HGPRT酶與 TK酶 ： 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶 胸腺嘧啶核苷激酶 （四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 應(yīng)用液： 8雜氮鳥嘌呤 聚乙二醇 HAT培養(yǎng)基： H（ Hypoxanthine） :次黃嘌呤 A（ Aminopterin）： 氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷 DNA合成主要途徑 T(Thymidine)： 胸 腺
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