單克隆抗體ppt課件-文庫吧資料
2025-05-12 13:10本頁面
【正文】 ? 采用 ELISA方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選出能夠產(chǎn)生抗原特異性抗體的陽性孔，對(duì)陽性集落孔進(jìn)行克隆 。 ? 融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的 HPRT與 TK ，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補(bǔ)救途徑合成 DNA，因此可在 HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。 ? （ 2） 融合所用的瘤細(xì)胞一般是 HPRT與 TK缺陷型 ，因此也不能采用補(bǔ)救途徑合成 DNA。 HAT培養(yǎng)基篩選法 ? 有培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤 （ hypoxanthine， H）、氨基蝶呤 （ aminopterin， A） 和胸腺嘧啶核苷 （ thymidine， T）， 所以取三者的字頭稱為 HAT培養(yǎng)基。 ? 正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅 5～ 7天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。將融合后細(xì)胞懸液加入 96孔板， 100μl ／孔， 37℃ 、 5％ CO2 孵箱培養(yǎng)。 ? 將其放置于事先準(zhǔn)備好的 37℃ 水浴中，將 PEG緩緩加到混合細(xì)胞上，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù) 90s后 ，移走水浴鍋，從 CO2培養(yǎng)箱取出溫育至 37℃ 的 50mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，用吸管吸取 10mL緩緩加到融合細(xì)胞上邊加邊輕輕攪拌（不能吹打），使細(xì)胞團(tuán)塊分散，先加 1mL，再加 2mL，再加 3mL，最后加完剩下的 4mL，加完第一個(gè) 10mL后，接著沿管壁加完剩下的 40mL，加完后，擰緊蓋，反復(fù)顛倒幾次，使細(xì)胞混勻。 ? （ 3） 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的 一定濃度、一定分子量 的 PEG，邊加邊攪拌 ，在室溫下融合。 取 1 107個(gè) SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫睥細(xì)胞混合 ? （ 2）將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按 1： 10或 1： 5的比例混合在一起，在 50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗 1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。骨髓瘤細(xì)胞濃度 =（四角 +中央中方格的細(xì)胞數(shù)） 5 104個(gè) /毫升 飼養(yǎng)細(xì)胞 ? 作用： ? 吞噬死亡及異常細(xì)胞 ? 提供生長因子 ? 危害： ? 吞噬融合細(xì)胞 ? 爭(zhēng)奪營養(yǎng) 4. 細(xì)胞融合 ? （ 1）取對(duì)數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌 2次。 ? ⑷ 1700r/min，水平離心 10min后，取出離心管可見，在骨髓瘤細(xì)胞懸液和淋巴細(xì)胞分離液的交界處有一層白色的細(xì)胞，這就是骨髓瘤細(xì)胞，用10mL吸管吸走上層細(xì)胞懸液后，將中層的骨髓瘤細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到另一支滅菌 50mL離心管中，用15mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液， 1200r/min， 5min,洗細(xì)胞兩次。 ? ⑶背部朝上固定小鼠，參照飼養(yǎng)細(xì)胞的制備方法，分離骨髓瘤（只要蠶豆大小的一塊瘤子即夠做一次融合了），勻漿制備骨髓瘤細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù) =4個(gè)大方格細(xì)胞 105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù) =5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù) 106/2 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法（二）： 飼養(yǎng)小鼠法 ? 將 Balb/c小鼠體內(nèi)生長的 SP2/0骨髓瘤勻漿后制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，然后再用于融合，其制備步驟如下： ? ⑴將背部皮下長出骨髓瘤的 Balb/c小鼠脫頸椎處死，用 75%的酒精浸泡 5min。 e、取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加 %臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。 d、加入 30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。 b、融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于 50ml離心管或融合管內(nèi)。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。 ? 通常采用 HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）與 TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞系。加 5mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液到 玻璃勻漿器 中，將脾臟 進(jìn)行勻漿 ， 直到看不見紅色的組織塊，補(bǔ)加 5mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液到玻璃勻漿器中，混勻后靜置1min，待白色的組織塊沉到管底后，吸出上層細(xì)胞懸液8mL，轉(zhuǎn)移到 50mL離心管中，補(bǔ)加 8mL RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液到玻璃勻漿器后再轉(zhuǎn)移一次。 ? 將小鼠兩后肢 交叉固定 (左后肢在上以便于脾臟的暴露 )，用小鑷子在遠(yuǎn)離脾臟的部位捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，將剪刀尖從小口伸進(jìn)去，打開剪刀將小口向兩邊撐開，再將小鑷子從撐開的小口伸進(jìn)去，夾緊并掛住腹膜向前撕扯，直到脾臟完全暴露。 但除非抗原來源困難或有其它目的，我們?nèi)詫?shí)行舊法，因免疫反應(yīng)的啟動(dòng)機(jī)制非常復(fù)雜，生物整體的免疫反應(yīng)還是最可靠。 ? 3 ) 有人 直接取出健康的脾細(xì)胞，在培養(yǎng)中加入抗原進(jìn)行體外免疫
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