13基因工程的操作過(guò)程2-文庫(kù)吧資料
2025-01-18 04:26本頁(yè)面
【正文】 ： kb + kb 或者： kb + kb pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 對(duì)圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用 EcoRI酶切開(kāi)后，只出現(xiàn) kb和 kb兩條帶子，實(shí)際上 kb的條帶中含有兩種不同的分子 kb kb E （二）克隆 DNA序列檢測(cè) 限制性酶切圖譜法 （ 2）部分酶解圖譜法： kb PstI EcoRI BamHI B B E kb kb E B 該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)： BamHI全酶解： kb BamHI+EcoRI全酶解： kb 其中 ， kb片段的存在表明該片段位于一端 BamHI部分酶解： kb 其中 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表 明兩者是連在一起的；同理 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者是連在一起的；最后 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者 是連在一起的 （二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或 DNA片段的 同源序列 設(shè)計(jì)并合成 探針 ，以此搜尋篩選含有目的基因的 目的重組子 。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應(yīng)）等 （ 2）顯色篩選法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ39。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的 37℃ 培養(yǎng)一個(gè)小時(shí) 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作 3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 （ 2）擴(kuò)增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序 擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選 表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過(guò)程 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) （二）克隆 DNA序列檢測(cè) （三）外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過(guò)程 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉(zhuǎn)化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗藥性篩選法可區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子、重組子 與 非重組子 將外源 DNA片段插在 EcoRI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs （ 2）抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉(zhuǎn)化液涂布含有 Ap的平板 再將 Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至 含有 Ap和 Tc的平板上 在 Ap平板上生長(zhǎng)、但在 Ap和 Tc平板上 不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為 重組子 Ap Ap + Tc 影印 挑選 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法 （ 1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子 ，一般不能區(qū)分 重組子 與 非重組子 。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體 DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納 DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)） 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 例如 ， pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108， 即每微克 pUC18中只有 108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞 。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素 （ 3） l噬菌體 DNA的轉(zhuǎn)染 感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液 ， 30℃ 保溫 10分鐘 轉(zhuǎn)染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃ 培養(yǎng) 2小時(shí)，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選 （ 4） 電穿孔轉(zhuǎn)化 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；?DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中 ， 兩極施加高壓電場(chǎng) 。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在 %的蔗糖等滲溶液中。 539。 539。 G G 339。 C 退火 C 339。 C 339。 GCATG 339。 G G 339。 GAATTC CTTAA G 539。 AATTC G 539。 G CTTAA OH 539。 G CTTAA p AATTC G 539。 539。 EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker 6. 重組率 （ 1）重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) 在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下 ， 重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo) ， 較高的重組率可以 大大簡(jiǎn)化 DNA重組
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