13基因工程的操作過程2-文庫吧資料
2025-01-18 04:26本頁面
【正文】 ： kb + kb 或者： kb + kb pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 對圖示的克隆片段，轉化子質粒DNA用 EcoRI酶切開后，只出現(xiàn) kb和 kb兩條帶子，實際上 kb的條帶中含有兩種不同的分子 kb kb E （二）克隆 DNA序列檢測 限制性酶切圖譜法 （ 2）部分酶解圖譜法： kb PstI EcoRI BamHI B B E kb kb E B 該重組質粒經酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據： BamHI全酶解： kb BamHI+EcoRI全酶解： kb 其中 ， kb片段的存在表明該片段位于一端 BamHI部分酶解： kb 其中 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表 明兩者是連在一起的；同理 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者是連在一起的；最后 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者 是連在一起的 （二）克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據克隆的目的基因或 DNA片段的 同源序列 設計并合成 探針 ，以此搜尋篩選含有目的基因的 目的重組子 。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產物能使細胞產生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應）等 （ 2）顯色篩選法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ39。在實驗時，擴增操作往往與轉化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導轉化后的 37℃ 培養(yǎng)一個小時 原生質體轉化后的再生過程 l噬菌體轉染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴增操作 3. 轉化細胞的擴增 （ 2）擴增操作的目的 增殖轉化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉化細胞用于篩選程序 擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選 表達外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 （一）載體遺傳標記檢測 （二）克隆 DNA序列檢測 （三）外源基因產物檢測 三、 轉化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉化子 與非轉化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標記檢測 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗藥性篩選法可區(qū)分 轉化子 與 非轉化子、重組子 與 非重組子 將外源 DNA片段插在 EcoRI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs （ 2）抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉化液涂布含有 Ap的平板 再將 Ap平板上的轉化子影印至 含有 Ap和 Tc的平板上 在 Ap平板上生長、但在 Ap和 Tc平板上 不長的轉化子即為 重組子 Ap Ap + Tc 影印 挑選 （一） 載體遺傳標記檢測 營養(yǎng)缺陷型篩選法 （ 1）營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉化子 與 非轉化子 ，一般不能區(qū)分 重組子 與 非重組子 。由于在一般的轉化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉化率的定義也可以表征為：每微克載體 DNA轉化后，受體細胞接納 DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長） 2. 轉化率 （ 1）轉化率的定義 例如 ， pUC18對大腸桿菌的轉化率為 108， 即每微克 pUC18中只有 108個分子能進入受體細胞 。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內含脯氨酸和微量元素 （ 3） l噬菌體 DNA的轉染 感受態(tài)細胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經體外包裝好的重組噬菌體懸浮液 ， 30℃ 保溫 10分鐘 轉染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃ 培養(yǎng) 2小時，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選 （ 4） 電穿孔轉化 將待轉化的質粒或 DNA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中 ， 兩極施加高壓電場 。在制備過程中，菌體應始終懸浮在 %的蔗糖等滲溶液中。 539。 539。 G G 339。 C 退火 C 339。 C 339。 GCATG 339。 G G 339。 GAATTC CTTAA G 539。 AATTC G 539。 G CTTAA OH 539。 G CTTAA p AATTC G 539。 539。 EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker 6. 重組率 （ 1）重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) 在常規(guī)實驗條件下 ， 重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應效率的重要指標 ， 較高的重組率可以 大大簡化 DNA重組
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