四、基因工程的操作過程-文庫吧資料
2025-01-23 20:20本頁面
【正文】 選擇過程 ?半乳糖苷酶使 Xgal分解成蘭色產(chǎn)物?？梢员?IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 ?半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 Xgal 半乳糖 5溴 4氯靛藍(lán) + + 深藍(lán)色 1. 原理： 載體上有一段 ?半乳糖苷酶基因（ Lac Z）的 ?片段（氨基端），其上有外源 DNA的插入位點(diǎn)。 2. 插入表達(dá)篩選法 將一段負(fù)調(diào)控序列重組到標(biāo)記基因上游，用于抑制標(biāo)記基因的表達(dá)。 Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。 殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。 pBR322 （ 1）四環(huán)素： （ 2）氨芐青霉素抗性基因： 2） pBR322抗菌素標(biāo)記選擇 產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。 1. 插入失活法 1） 原理： pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因 : Tetr上有插入位點(diǎn) BamH I和 Sal I。 得到的不一定是期望重組子，需進(jìn)一步鑒定。 2. 注意問題 做對照。 （ 3）氯霉素抗性基因： 表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT），使 Cm乙?；?。 第一節(jié) 依賴于表型特征篩選法 一、利用載體提供的表型特征篩選 pBR322 pHC79 MCS pUC18/pUC19 ori Ampr lacZ’ lacI M13 ori pUC118/119 （ 1）四環(huán)素 抗性基因 ： （ 2）氨芐青霉素抗性基因： 1. 常用 抗性遺傳標(biāo)記 產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，可降解環(huán)境中的 Amp，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。 轉(zhuǎn)化子 重組子 期望重組子 A 抗藥性標(biāo)記篩選 人工構(gòu)建的質(zhì)粒、柯斯質(zhì)粒、噬菌體質(zhì)粒都帶有抗藥性基因作為篩選標(biāo)記，正向選擇，初步篩選。 4. DEAE葡萄糖傳染法 二乙氨乙基（ DE AE ）+ + + + + + + + +++++++++++++++DNA 二乙氨乙基（ DEA E ）+ + + + + + + + +++++++++++++++葡聚糖 葡聚糖 +DNA 吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分 DNA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。 直接把外源 DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。 依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有 10%的細(xì)胞能吸收 DNA沉淀。 （ 1）原理： 三、導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 1. 磷酸鈣沉淀法 HEPES緩沖液與含有氯化鈣－ DNA的溶液緩慢混合，會形成含磷酸鈣－ DNA的沉淀。 用人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜包裹 DNA，通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或原生質(zhì)體的吞噬，把外源 DNA轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)。關(guān)鍵步驟：固定細(xì)胞 多聚物如 PEG、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸和二價(jià)陽離子（ Mg2+、 Ca2+）與 DNA混合，可在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，同時(shí)引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間識別，使原生質(zhì)體內(nèi)吞噬外源 DNA. 瓊脂糖包埋法、多聚賴氨酸連結(jié)法、吸管支持法 將外源 DNA涂在授粉的枝頭上，使其沿著花粉管經(jīng)過珠心進(jìn)入尚未形成正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移?？蓽p少對細(xì)胞的損傷。先在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，用激光源代替熒光，發(fā)生激光束脈沖造成膜穿孔，使周圍DNA進(jìn)入細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化方法： 葉盤轉(zhuǎn)化法 整體植株接種轉(zhuǎn)化法 原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法 葉盤 消毒 切取 土壤農(nóng)桿菌浸泡 看護(hù)培養(yǎng)基 愈傷組織 分化幼苗 葉盤法（ leaf disk) 植物細(xì)胞 原生質(zhì)體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入電擊緩沖液 12kV電擊 愈傷組織 幼苗 分化 1. 電擊法（ electroporation) B 直接轉(zhuǎn)移法 又稱 高速微型子彈射擊法（ Highvelocity microprojectiles)，利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時(shí)能進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)象，將包在金屬顆粒表面的外源 DNA分子隨之帶入細(xì)胞內(nèi)。 轉(zhuǎn)化 酵母 插入外源基因的酵母載體 感受態(tài) 40% PEG 4000 （ 2）利用 Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化 二 導(dǎo)入植物細(xì)胞 A 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌（ ）感染所致，其致瘤特性是由該菌細(xì)胞內(nèi)的野生型質(zhì)粒 Ti（ Tumorinducing）介導(dǎo)的。 一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞 1. 菌株選擇 如： ura352, trp1289, leu23, leu2112, his3? 1 ?重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞 ——酵母菌、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞 （ 1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化 2. 酵母的轉(zhuǎn)化方法 酵母 原生質(zhì)體 感受態(tài) 酶去壁 CaCl PEG 插入外源基因 的酵母載體 pEG（聚乙二醇）使 細(xì)胞壁 具有通透性，允許DNA進(jìn)入。（每 ?g ?DNA能形成 106噬菌斑）。 （ 4） 互補(bǔ)型噬菌體 外殼蛋白基因 D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部）。 cI857 其它基因 溶源狀態(tài)（ ?DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯） ?DNA 阻遏 蛋白 阻遏 蛋白 44℃ — 45℃ ?DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白 32℃ ?噬菌體 1 外殼蛋白基因 E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。 但當(dāng)溫度升高到 44℃ — 45℃ 時(shí)，就會導(dǎo)致 cI基因編碼的阻遏蛋白失活， ?DNA復(fù)制、外殼蛋白合成，便于提取外殼蛋白。 6. 體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo) （ 2）體外包裝（ in vitro packaging） （ 1）轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） 通過受體菌細(xì)胞表面的 ?DNA接受器位點(diǎn)（ receptor site)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。 （ 2）感受態(tài)細(xì)胞 （ petent cells) （ 3）轉(zhuǎn)化手段 電穿孔法比熱休克法轉(zhuǎn)化率高。 ② 必須在冰冷的條件下制備。C 1分鐘 加入 1mL LB培養(yǎng)基 37℃ 搖 1小時(shí) 10100?L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板 （吸附 DNA） （攝入 DNA） （ 1）熱休克法 迅速移入冰浴 3－ 5min LB培養(yǎng)受體菌至OD600= 冰浴 15分鐘， 2℃離心集菌 低鹽 buffer重懸菌體 2 ℃ 離心集菌 低鹽 b重懸
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