基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用-文庫吧資料
2024-08-18 04:30本頁面
【正文】 長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實(shí)現(xiàn)高密度高表達(dá)的關(guān)鍵。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應(yīng)用?，F(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、proUK、MT、MCSF及Hb等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠?；蚬こ逃N技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4 405個開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，％。該方法以營養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時間，通過兩輪基因組改組就從24 000株菌株中分離到2組共14株泰樂菌素高產(chǎn)菌株，其泰樂菌素產(chǎn)量高于通過經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長達(dá)20年的時間中先后篩選過約1 000 000個菌株后才獲得的。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體融合再生再制成原生質(zhì)體融合再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對象從單個基因擴(kuò)展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。由于此方法是在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。圖5 交叉延伸程序的基本過程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近幾年來，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。此技術(shù)是在一個PCR反應(yīng)體系中以2個以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。其操作的原理和步驟如圖4。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機(jī)大小的DAN片段，然后進(jìn)行PCR重聚。；，在pH。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯配水平。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯PCR(Error_prone PCR，簡稱EP—PCR)。例如，利用定點(diǎn)突變改變酪氨酰tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。在多位點(diǎn)的突變試驗(yàn)中，TAMS誘變技術(shù)應(yīng)該是首選方法。該方法主要分3步(圖2)：(1)線性單鏈DNA模板的制備：通過線性PCR制備單鏈DNA模板；(2)突變鏈的合成：該步驟需用2個錨錠引物(即Anchor5和Anchor3)和多個誘變引物(Mut1和Mut2)。tube megaprimer PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù) 2003年，Young等報道了一種有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈的定點(diǎn)誘變技術(shù)(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。在以PCR為基礎(chǔ)的誘變方法中，該法是引入單位點(diǎn)突變最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法。這種單管大引物法的優(yōu)點(diǎn)是：實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，大幅簡化了操作步驟，并且省時、省力。Ke等在此方法中還提出了2條更為細(xì)致、有效的改進(jìn)措施，使PCR產(chǎn)物的最終產(chǎn)量和純度均有所提高。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡單(圖1)。單管大引物PCR Picard等和HKe等分別建立了單管大引物PCR法。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Extension PCR簡稱EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，簡稱OOE．PCR)、單管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、快速定點(diǎn)誘變法、多位點(diǎn)環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點(diǎn)誘變技術(shù)。 運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的新技術(shù)1． 基因的定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變(site—specific mutagenesis或site—directed mutagenesis)是指在目的DNA片斷(例如：一個基因)的指定位點(diǎn)引入特定的堿基對的技術(shù)，其包括寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式誘變以及以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)
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