基因工程重組人干擾素-文庫吧資料
2025-07-03 02:40本頁面
【正文】 糖體結(jié)合位點的高效轉(zhuǎn)錄二表達體系 , 可以使 IFN γ的表達也達到 4 109U/L 的水平。實驗表明未誘導(dǎo)時產(chǎn)量為 6 104UA, 而誘導(dǎo)后產(chǎn)量可達到 1 107UA 。酵母是一種較為常用的表達宿主 , 但其外源基因的大量表達必須在缺少元機磷的條件下才能進行。對其序列的研究表明 , IFNR 在竣基端的 13 個氨基酸以及 TNF 下在氨基端的 23 個氨基酸均對它們的生物活性沒有影響 , 因此在設(shè)計構(gòu)建 IFN γ與 TNER 嵌合物時可以將其去除 , 利用色氨酸啟動子構(gòu)建的含有 IFNE γ氨基端 134 個氨基酸及 TNFP 竣基端 148 個氨基酸的表達質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖 1250此外 , 基因工程在抗體技術(shù)上的應(yīng)用使干擾素與抗體能夠有機地結(jié)合 , 通過抗體的靶向作用 , 增強干擾素的定向能力 , 提高干擾素體內(nèi)作用的效率。離心后將上清用單克隆抗體親和層析柱純化兩次 , 將純化后的活性干擾素溶于 PBS 后利用超濾膜 YM10 濃縮至 1~3 時 , 再將濃度調(diào)整到 IIIgmlo 利用 SDS 聚丙烯酷膠電泳對于擾素的純度進行測定。含有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的大腸桿菌 HT2 在 M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)到 OD650 為 5~8 時 , 離心得到細胞 , 并用含 100mmoIATrisHC1 、 、 5mmolAEDTA 及 。為構(gòu)建嵌合干擾素 , 可先將親代干擾素的編碼序列在相同位點 S1(Sa113A I ) 、 Pv(PVUE) 、 S2(Sa113A I ) 切斷 , 產(chǎn)生含有氨基端 1~60 、 1~92 、 61~92 、 93~150 、 93~166 、 151~166 位氨基酸的片段 , 用 6% 的聚丙烯釀膠凝膠電泳分離 ( 圖 124) 。下面就這兩種情況分別舉例介紹。用表面活性劑右旋糖所活化 COEL1 細胞 , 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入并培養(yǎng) 48h 后離心 , 上清液中便含有干擾素。通過電泳分出插入片段大于 6000 坤 , 即含有完整 MuIFNY 的質(zhì)粒 , 用 PvuII 酶切 , 六個切點中有一個位于 539。用含人 IFN γ編碼區(qū)基因的探針與噬菌體γ MG9 構(gòu)建的鼠 M600 基因組 DNA 文庫在 20% 甲酷膠中進行低嚴格性的雜交 , 膜用 、 擰棱酸納及 %NaEbS04 在室溫洗滌兩次。 舊 M 培養(yǎng)基 , 繼續(xù)培養(yǎng) 2 周以上 , 檢查 IFNP 活性。 2 μ g/mL 、霉盼酸 25 問 /mL 的 DhEM 培養(yǎng)基 ,37 ℃ cq 孵箱中選擇性培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染液中含目的基因 pSVHIF 和標記基因 pSVZgpt( 比值為 10:1), 其中 DNA 濃度為 20 μ g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 陣、 10mmolATrisHCl (pH )428 μ L 中緩緩加入 2 HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、 、 Na2HP04,pH ) 約 500 μ L, 加入 sp2/0 細胞培養(yǎng)物中 , 輕輕搖勻 37 ℃孵育 8h 。具體操作步驟如下 : 將含有人 IFNp 基因的重組質(zhì)粒 pBV92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分別作為探針模板及插入片段 , 同時用 PvuII 切載體 pSVZdhfr 質(zhì)粒 , 使其線性化后將外源基因插入。 目的表達將人 IFNR 基因 HimdE 片段插人載體 pSV2dhfr 中 SV40 晚期啟動子 PL 下游的 Pvu E 位點。取 沉淀加至 含 3 106 個細胞的培養(yǎng)液中 ,12h 后換液一次 , 再培養(yǎng) 4d, 即可得到重組病毒 BmIFN2B310 。將從基因文庫中用 183bp 探針調(diào)出的在 ATG 后含有 Sma I 位點 ( 即有序列 CCCGGGATG) 的 IFNm α J 基因片段連接到 p89B310 上 , 便構(gòu)建成質(zhì)粒 pIFN2B310 。氣 mnlAd EDTA 終止反應(yīng)。利用從感染脂肪體 mRNA 制得的 CDNA 為探針 , 對其多角蛋白序列進行檢驗 , 其中 的 EcoR I 片段及 燦的 HindE 片段可與探針雜交 , 將 燦的 EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 產(chǎn)生質(zhì)粒 pBmE360 對其用 HindE 切 , 得到 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 圖 123 中為黑色框架 ), 將該片段插入 pUC9 的 HindE 位點 , 產(chǎn)生質(zhì) | 粒 p9H18 。下面便以人 IFN, α的生產(chǎn)為例介紹家蠶表達體系在干擾素生產(chǎn)中的應(yīng)用。干 | 擾素最初是用其外源序列進行表達的 , 但近年來的研究表明嵌合表達的干擾素往往優(yōu)于單一干擾素 , 因此出現(xiàn)了較多的嵌
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