【正文】 操作順序如下圖：檢 樣80℃，加熱5min冷卻37℃以下加菌液，36℃177。（見(jiàn)表24）表 24 顯色狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)（GB4789）顯色狀態(tài)判斷未顯色者陽(yáng)性微紅色者可疑桃紅色～紅色陰性（4）每份檢樣作兩份，同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照各一份，陽(yáng)性對(duì)照用無(wú)抗生素乳8ml加1ml青霉素溶液（／ml）及菌液1ml和4%。（3）結(jié)果觀察 乳中有抗生素存在時(shí)，加入指示劑TTC后牛乳不顯色，即抗生素陽(yáng)性；相反，如果沒(méi)有抗生素存在，則加入TTC后顯紅色，即抗生素陰性。1℃水浴培養(yǎng)2h后，向試管內(nèi)加4%，36177。（1）取待檢乳液9ml，置滅菌試管中，80℃水浴加熱5 min。再轉(zhuǎn)接2~3次，以活化菌種脫脂乳培養(yǎng)基，經(jīng)36177。 菌液制備將凍干保存的嗜熱性乳酸鏈球菌接種于滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中，36177。 TTC法 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的TTC實(shí)驗(yàn)法并參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。紙片法: 青霉素標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確稱(chēng)取青霉素G鉀標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用磷酸鹽緩沖液溶解，制備為1 000g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存。其中：檢測(cè)反應(yīng)管 502營(yíng)養(yǎng)藥片 100 片取樣注射器 1支取樣吸頭 100支鑷子 1支使用說(shuō)明書(shū) 1份 試驗(yàn)方法 原料預(yù)處理 TTC法: 依據(jù)GB4789 2794方法檢測(cè)抗生素殘留。如遇溶液變?yōu)榫G色或淡褐色，則不能再用。（3）試劑TTC指試劑：4% 2,3,5氯化三苯基四氮唑（TTC）批號(hào)830222。 ～ b 溶液或試劑：牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂，1mol／L NaOH，1mol／LHCL。 水 蛋白胨表22 對(duì)照樣品表對(duì)照樣品編號(hào)來(lái)源脫脂乳+青霉素14脫脂乳: 東北農(nóng)大食品實(shí)驗(yàn)室提供青霉素: 天林藥業(yè)有限公司提供滅菌生理鹽水+青霉素15NaCL: 天林藥業(yè)有限公司提供青霉素: 天林藥業(yè)有限公司提供無(wú)抗脫脂乳16市售滅菌生理鹽水17市售嗜熱乳酸鏈球菌，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品研究中心提供；枯草芽孢桿菌，由黑龍江東方學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法 實(shí)驗(yàn)材料 從哈市食品商場(chǎng)隨即采取六個(gè)主要品牌不同品種的袋裝消毒純牛奶及其相關(guān)品牌的花色奶作為檢樣，將采集的樣品編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，乳樣共計(jì)13份，見(jiàn)表21。 抗生素的檢測(cè)方法很多， 主要可以分為微生物測(cè)定法、理化測(cè)定法和免疫學(xué)測(cè)定法[15] 等?？股貦z測(cè)的方法、 檢測(cè)技術(shù)也隨之迅速發(fā)展，只有簡(jiǎn)便 、快速 、準(zhǔn)確 、靈敏性高的檢測(cè)方法才能滿足日趨嚴(yán)格的檢測(cè)要求?？股氐挠绊懯顾崮?、奶酪等一些高質(zhì)量的牛乳產(chǎn)品無(wú)法加工生產(chǎn)，造成大量的原料奶浪費(fèi)，致使企業(yè)遭受很大的經(jīng)濟(jì)損失。但飲用含有抗生素殘留的牛奶可引起細(xì)菌耐藥性， 導(dǎo)致人體過(guò)敏反應(yīng)等癥狀。比利時(shí)UCB Byproducts公司開(kāi)發(fā)的Penzym檢測(cè)法有兩種形式:Penzy和PenzymS，它們的區(qū)別是培養(yǎng)時(shí)間和靈敏度不同，此方法適用于檢測(cè)B內(nèi)酰胺類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)抗生素。 基于受體分析法比利時(shí)UCB Byproducts公司開(kāi)發(fā)的BetaSTAR檢測(cè)法是將特定的B內(nèi)酰胺受體蛋白固定在試紙上，用膠體金有色微粒作為標(biāo)記物，5min內(nèi)可以檢測(cè)到青霉素和頭孢菌素殘留。在檢測(cè)結(jié)果方面，不僅可以知道結(jié)果的陰性陽(yáng)性，而且也可了解所檢測(cè)的結(jié)果是哪一類(lèi)抗生素。Snap法是美國(guó)IDEXX Laboratories Inc公司采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)原理，將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方法，其敏感性和特異性較好。Delvotest Cow Test與DelvotestP小型安碚瓶格式除外裝不同外，內(nèi)容物和用法基本相同，還配有加熱池，更適合牛奶場(chǎng)使用。DelvotestSP則可以檢測(cè)包含B內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在內(nèi)的更多抗生素(如磺胺類(lèi)、泰樂(lè)霉素、紅霉素、鏈霉素、慶大霉素、三甲氧卞二氨嘧啶等)。瓊脂裝在小型安碚瓶里的格式適用于小規(guī)模和單個(gè)試驗(yàn)，微孔板格式一次可以同時(shí)檢測(cè)96個(gè)乳樣，適用于大批量乳樣檢驗(yàn)。 荷蘭Gistbrocades BV公司開(kāi)發(fā)了DelvotestP，DelvotestSP，Delvotest Cow Test，DelvotestMCS檢測(cè)系列[14]。常見(jiàn)的聯(lián)用技術(shù)包括：GCM S、LCM S、SFCM S、CZEM S 等。張素霞等報(bào)道了用 M SPDHPLCUV 分析法檢測(cè)牛奶中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留。 聯(lián)用技術(shù) 各種分析技術(shù)聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析的發(fā)展趨勢(shì)。UVD 對(duì)環(huán)境溫度，流動(dòng)相組成和流速變化不敏感，能適應(yīng)等度和梯度洗脫[13]，對(duì)強(qiáng)紫外吸收的物質(zhì)的檢測(cè)限可以達(dá)到 1ng以下。目前絕大多數(shù) HPLC 系統(tǒng)都配備有該種檢測(cè)器。 HPLC使用的檢測(cè)器 目前在殘留分析中使用的主要HPLC 檢測(cè)器為紫外可見(jiàn)（UVD）、熒光（FLD）和電化學(xué) (Echo）檢測(cè)器。 高效液相色譜法 HPLC 是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。但理化檢測(cè)程序復(fù)雜，且費(fèi)用較昂貴。它包括波譜法、色譜法及其聯(lián)用技術(shù)，如 HPLC、GC、薄層色譜法（ TLC）、毛細(xì)管電泳（CE）等。目前仍有許多關(guān)于新技術(shù)和方法的報(bào)道，如 Gaudin 發(fā)表了生物傳感器方法測(cè)定 β 內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素殘留方法。它所用的菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌。由于使用快速方便，價(jià)格更低，因此適合奶牛場(chǎng)的抗生素快速檢測(cè)。它可檢測(cè)的抗生素種類(lèi)更多，包括青霉素 G、氨芐青霉素、頭孢噻林、新霉素、土霉素、阿莫西林、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、四環(huán)素、金霉素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、泰樂(lè)菌素和甲氧芐氨嘧啶等。 DelvotestSP（ 戴爾沃檢測(cè)法） DelvotestSP 檢測(cè)法是由荷蘭 Gistbrocades BV 公司開(kāi)發(fā)的。也就是說(shuō)當(dāng)檢樣呈乳的原色時(shí)為陽(yáng)性，微紅色是為可疑，桃紅色或紅色時(shí)為陰性。乳樣中有抗生素存在，則在向檢樣中加入菌液培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌不增殖，此時(shí)由于加入的指示劑 TTC 不還原，所以不顯色。 TTC 法 TTC 法，即氯化三苯四氮唑試驗(yàn)，它是目前我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測(cè)牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)方法[10]。 常用的紙片法包括枯草桿菌紙片法和嗜熱脂肪桿菌紙片法[9]，主要用于檢測(cè)牛奶中的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。但該方法必須經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)才能觀察到結(jié)果，測(cè)定的結(jié)果與試驗(yàn)菌株的敏感性，瓊脂平板中的試驗(yàn)菌株數(shù)，培養(yǎng)基及其成分的pH值有關(guān)，且通過(guò)肉眼判斷顯色狀態(tài)，容易產(chǎn)生誤差。 牛奶中抗生素殘留檢測(cè)研究進(jìn)展 微生物檢測(cè)法微生物檢測(cè)法測(cè)定原理是根據(jù)抗生素對(duì)微生物的生理代謝作用的抑制作用，來(lái)定性或定量確定樣品中抗生素的殘留[8]，如紙片法（PD法），TTC 法，拭子法（STOP）等。丁潔等在2003 年對(duì)南京市牛奶中抗生素殘留進(jìn)行了調(diào)查[6]，發(fā)現(xiàn)消毒牛奶、奶粉、% 、% 、% 、% ；廣州市衛(wèi)生防疫站對(duì)廣州市牛奶中抗生素殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如下：消毒牛奶、奶粉、嬰幼兒奶粉和生牛奶的陽(yáng)性率分別為21% 、39% 、44% 、60% 。歐美國(guó)家多年前即已明文禁止抗生素殘留超量的牛奶上市（對(duì)青霉素類(lèi)藥物的限量為 4～10μg/kg）。 牛奶中抗生素殘留的現(xiàn)狀牛奶中抗生素殘留問(wèn)題日益受到國(guó)際社會(huì)的重視[5]。 某些奶牛場(chǎng)由于操作不規(guī)范，在尚未徹底清洗和消毒患乳房炎的奶