免疫標記技術ppt課件-文庫吧資料
2024-11-09 17:36本頁面
【正文】 白質樣品。 ? 免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進行免疫學分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度（可檢測到低至 1～ 5ng中等大小的靶蛋白）。通過分析著色位置和深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。 ? 免疫印跡法 ? 免疫印跡（ immunoblotting）又稱為 Western印跡（ Western blotting），是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。在 LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。一個親和素可與 4個生物素分子結合，把 ABS與 ELISA法可分為酶標記親和素 生物素（ LAB）法和橋聯(lián)親和素 生物素（ ABC）法兩種類型 。 ? ABSELISA法： ABS為親和素（ avidin）生物素（ biotin）系統(tǒng)（ system）的略語。再與底物作用，呈色即與標本中的 IgM成正相關。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。此時必須先將標本用抗 IgG抗體處理，以除去 IgG干擾。如用抗原包被的間接法直接測定 IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的 IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使部份 IgM抗體不能結合到固相上。 ? 捕獲包被法：臨床檢驗中測定 抗體 IgM時多采用捕獲包被法。即先包被與固相抗原相應的抗體，再加入抗原形成固相抗原。 ? 如抗原純度高，可直接包被固相。其原理為標本中的抗體和一定量酶標記抗體競爭與固相抗原結合。 ? 制備關鍵在于酶標抗原，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。與間接法測抗體不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。 ? 雙抗原夾心法：反應模式與檢測抗原類似。 ? 間接法成功的關鍵在于抗原純度。 ? 主要用于檢測病原體抗體診斷傳染病。 ? 測定抗體的方法 ? 間接法 ? 雙抗原夾心法 ? 競爭法 ? 捕獲包被法 ? ABSELISA法 ? 間接法：是目前最常用的方法。 ? 加入酶標記抗抗體和底物顯色，顯色的深淺僅表示剩余的抗體量。 ? 抑制性測定法：先用抗原包被固相載體，然后分為兩組，一組加入用參考抗體和待檢標本混合孵育后的混合溶液，另一組不加待檢標本只加參考抗體。 改良雙抗體夾心法 ? 這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加一層抗體，放大倍數(shù)更高，故更靈敏。孵育洗滌后加入未標記的特異性抗體 b，抗體 b和第一次包被于固相載體上的特異性抗體 a對被測抗原都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備，否則可出現(xiàn)非特異性反應。 ? 雙抗體夾心法只適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。 雙抗體夾心法 ? 此法適用于臨床檢測各種蛋白質等大分子抗原，例如 HBsAg、 HBeAg、 AFP、 hCG等。 ? 缺點是需要較多量的酶標記抗原。因此，常用對小分子抗原如激素和藥物類的測定。經(jīng)洗滌后分成兩組，一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液；另一組只加酶標記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物的降解量之差，即為所要測定的未知抗原量。 ? 酶聯(lián)免疫吸附實驗 （ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA） ? 與固相 RIA原理相似，將抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體的反應在固相載體表面進行。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原，后者主要測定可溶性抗原與抗體。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標抗體可保存較長時間。 ? 應用酶標測定儀可作定量分析、敏感度可達 ng水平。 ? 但由于有放射性污染，近年有逐漸被非放射性免疫分析法取代的趨勢。
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