【正文】 機相與洗滌液一起振蕩 ， 對測定干擾較大分配比小的雜質(zhì)用反萃取方法使之進入水相 。 洗滌液的基本組成與試液相同 ， 不含藥物 。 靜置分層：通常在旋渦振蕩儀上振搖萃取后 ， 靜置梨形分液漏斗或萃取試管 ， 使水相與有機相分開 ， 然后將兩相分離 。 ⑤ 液 — 液萃取的操作步驟 在選好有機相后 ， 可根據(jù)樣品的體積按下列步驟萃?。? 萃?。河?60125ml容積的梨形分液漏斗進行萃取 ， 也可在帶塞的試管中進行 ， 以便振搖 。 分配到有機相中的比例增加 ， 提高其萃取率 。 表 112 液 液萃取常用有機溶劑 品種 極性 （ ε 176。另一液相有機相是必須通過比較來進行選擇的 。 溶劑 影響液 液萃取的效率的另一個主要因素就是有機相品種 。 減少干擾 “ 雜質(zhì) ” 的提取量； 在萃取過程中加入少量的醇類 ， 以減少容器表面對藥物的吸附 。 盡可能選擇極性較小的溶劑 。 根據(jù) HendersonHasselbalch方程可以估測 ， 弱堿性藥物的最佳 pH值應高于其 pKa值 23個單位 。 這 些藥物較難被定量萃取分離出來 。 為了提高其萃取率 ， 將 pH值調(diào)至 =+lg[A]/[AH] [A]/[AH]= 說明在此條件下有 97%以上的藥物可被提取 。 假設某動物正常血漿的 pH值為 ， 則血漿中解離的藥物濃度 [A]與非解離的藥物濃度 [AH]之比應為 =+lg[A]/[AH] [A]/[AH]= 說明只有 %的藥物是以未解離形式存在。 水相最佳 pH值可根據(jù) HendersonHasselbalch方程計算求出： pH=pka+lg[A]/[HA] （ ） 其中 [A]和 [HA]分別表示藥物的堿式和酸式濃度。 在實際工作中，主要是根據(jù)藥物的 pKa值來確定水相的 pH值。 水相的 pH值：大多數(shù)體內(nèi)使用藥物相對機體來說都屬于弱酸或弱堿性化合物。 就一般血藥濃度分析的基本要求而言 ， 萃取率不應低于 50%。 即如果一次萃取要求E%達到 %， 則藥物在兩相中的分配比應大于 1000。 ③ 萃取率 萃取率表平衡時 ， 藥物在有機相中的量與藥物總量之比 。 不考慮藥物在兩相中所存在的形式 ， 將藥物在水相和非水相的總濃度之比定義為分配比 ， 用符號 D表示 （ ） 容易看出 ， 當兩相的體積相等時 ， 如分配比 D大于 1， 則表示藥物在非水相分配的量高于在水相中的量 。 實際上 ， 每一種形態(tài)在兩相中都有各自的分配系數(shù) ，不能用單一的分配系數(shù)來表征萃取過程中的平衡問題 。 在水相與非水相中分布達到平衡時 ， 則有分配系數(shù) （ ） 其中 ， kd為分配系數(shù) ， 與溶質(zhì) （ 待測藥物 ） 、 溫度 、 溶劑對和各相的 pH相關； [A非 ]和 [A水 ]分別代表藥物在非水相和水相中平衡時的濃度 。選用與水不相混溶的有機溶劑進行萃取，是利用藥物在水與非水兩個相中分配不均勻的特性為基礎的一種分離提取法。 掌握液 — 液萃取的基本原理對于藥物定量分析具有重要應用意義 。 所謂溶劑解即是指某些藥物和硫酸結合所形成的酯 ， 可以隨加入的萃取溶劑在萃取時發(fā)生分解 。所以，有時對樣品中的藥物要作水解處理，使結合狀態(tài)藥物和代謝物游離出來。在體內(nèi)許多藥物一般在肝臟與葡萄糖醛酸結合成葡萄糖醛酸甙或與硫酸結合成硫酸酯，有的可與甘氨酸、醋酸等結合。 常見有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的用量見表 11－ 1： 表 111 能使 90%以上血漿蛋白發(fā)生沉淀常用有機溶劑的用量 有機溶劑 上清液 pH值 每容積血漿加入沉淀劑的容積 甲醇 乙醇 910 乙腈 丙酮 910 用石油醚去脂的用量通常為樣品容積的 35倍 。 生物組織中所含的脂類有時對樣品藥物含量測定產(chǎn)生較大影響 。 很多有機溶劑如乙腈 、 丙酮 、 甲醇可與水發(fā)生混溶 。 有些試劑可使血液中蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析和脫水作用 ， 使蛋白質(zhì)沉淀出來 。 重金屬離子與酸類相反 ， 在高于蛋白質(zhì)等電量的 pH值時 ，其陽離子與蛋白質(zhì)中的負電荷的羧基形成不溶性鹽而發(fā)生沉淀 。 重金屬離子蛋白質(zhì)沉淀劑包括汞鹽 、銀鹽 、 鋅鹽 、 銅鹽等 。 如在利用比色法測定血液中磺胺類藥物含量時 ， 通常是利用三氯乙酸來沉淀血液中蛋白質(zhì) ， 然后在酸性條件下進行重氮化反應 ， 顯色后進行比色測定 。 其中以生成不溶性鹽沉淀法應用較廣 。 其中以沉淀法使用較多 。 （ 2） 干擾組分的消除 血藥濃度的測定中 ， 干擾組分通常包括血漿蛋白質(zhì)及其脂類 。 在藥品定量分析中應盡可能提高其樣品處理的回收率 。 一般定量分析要求其回收率達到 80%以上 。 0TQ%100/ 0 ?? TT RTQ 由于在分離和富集過程中 ， 由于揮發(fā) 、 分解或分離不完全 ，處理器具的吸附作用以及其他人為因素可能造成部分組分丟失 ，所以其回收率通常小于 100%。 其中在藥物分析中樣品的預處理常用的是沉淀法 、 和溶劑萃取法 。 在定量分析中 ， 存在著如下幾種情況時 ， 則必須對樣品首先進行分離富集預處理：樣品中存在干擾物質(zhì)；樣品的物理 、化學狀態(tài)不適于直接進行測定；沒有合適的標準參照物；待測藥物或代謝物在樣品中分布不均勻；待測藥物的含量極低 ， 低于現(xiàn)有檢測方法的檢測限 。通過分離，可以把干擾組分分開，以提高檢測方法的專一性。藥物動力學研究中，通常是要測定體液中藥物的含量，且藥物濃度較低，絕大部分達到微量水平。在測定之前必須將體液中的藥物提取。 反復冷凍的生物組織特別是細胞也會發(fā)生變性 、 壞死現(xiàn)象 。 不得將解凍樣品再進行冷凍貯存后再解凍測定 。理想的冷凍溫度范圍為 40℃ 80℃ 。 血樣中的抗凝全血通常只能在 4℃ 冰箱保存 ， 溫度過低自然會引起因解凍而發(fā)生溶血 。 若在室溫下保存 ，應在采樣后立即加入對藥品及其代謝物測定無干擾的防腐劑 。 尿液的主要成分是水 、 尿素 （ 禽類為尿酸 ） 及鹽類 ，比較適合于細菌繁殖與生長 ， 所以最好在收集到尿樣后立即進行測定 。因為尿液藥物濃度變化較大，要反映藥物在體內(nèi)的代謝排泄過程，必須定時收集一定時間內(nèi)的尿液，并對整個的排尿量要進行確定。同時也可用于藥物乙?；x（如磺胺類藥物）和氧化代謝多態(tài)性（如喹噁啉類藥物）等的研究。 血漿和血清應放在 20℃ 條件下保存 。 制備血清時 ， 防止過早撥動血塊；寒冷會使紅細胞脆性增大 ，制備血清時 ， 應將血液放入 37℃ 培養(yǎng)箱預熱 30分鐘后 ， 用針頭從管壁剝離 ， 并繼續(xù)保溫使血清析出 。對于血漿和血清，發(fā)生溶血時還會增加藥物定量分析的干擾成分。 本品化學結構中含有 N和 Na元素 ， 不適宜于含氮化合物和鈉的測定 。 25%的枸櫞酸鈉 1ml血液 。 另外草酸鉀對血液中酶如乳酸脫氫酶 、 酸性磷酸酶 、 淀粉酶有抑制作用 。 10%的草酸鉀 5ml血液 。 每 1ml血液加草酸鉀 2mg。 草酸鉀：由于其毒性作用不得作為體內(nèi)抗凝劑 。 如確認對待測藥品的測定無影響 ， 也可選用其他抗凝劑 。 值得說明的是 ， 血漿 （ Plasma） 是通過加抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取上層的清液 。 樣品得到后應立即處理測定 ， 如不能立即測定 ， 應置于 20℃ 以下冰箱中保存 。 血漿通常是添加肝素 ，經(jīng)離心 （ 1500r/min） 30分鐘分離得到 。否則，應提高檢測方法的靈敏度，以降低采血量。 所以，對于一個體重為 1kg2kg的家禽來講，每次采血量如果超過，一次藥物動力學試驗完成后，試驗動物機體血液會減少超過總血量 5%以上。從生理學角度分析，動物血液量占體重平均為 57%左右。 采樣量對于大動物來說（例如每次采集 5ml血液）影響相對較小。每次采血量以能夠滿足 3次重復測定所需量為度。因為藥物動力學是研究藥物在機體內(nèi)吸收，分布，代謝和排泄的規(guī)律的一門科學，所采血樣的多少自然會影響藥物在體內(nèi)過程的量的變化。 在很少情況下 ， 未能在預定采樣間隔點采得樣品 ， 可利用線性插入法在相應時間點按下式補上數(shù)據(jù)： （ ） 其中 Cf為插入時間點 tf的相應濃度 ， C1和 C2分別表示插入時間點 tf前面的時間點 （ t1） 和 tf后面的時間點 （ t2） 的濃度 。 采樣時間應準確，時間誤差不得大于 177。 在進行生物利用度測定或藥物的生物等效性測定時 ， 如果是以血液為監(jiān)測指標 ， 則要求在最大血藥濃度出現(xiàn)后 ， 繼續(xù)采集 34個半衰期時間的樣品；如果是以尿液為監(jiān)測指標 ， 則要求在最大尿藥濃度出現(xiàn)后繼續(xù)采集 78個半衰期時間內(nèi)的樣品 。如果吸收很快，在給藥 ，可考慮在 10分鐘增加一次采血，并在 20分鐘時增加一次采血。并在 2倍峰值左右安排一次采血。 在進行血管外途徑給藥時（如內(nèi)服，肌注，皮下注射，直 腸給藥，皮膚給藥等），其血樣采集時間要根據(jù)藥物吸收的快慢和代謝特點來安排。 靜注給藥后一般是在 5分鐘 、 10分鐘 、 15分鐘 、 30分鐘 、 1小時 、 2小時 、3小時 、 4小時 、 6小時 、 8小時 、 12小時 、 16小時 、 24小時 、 32小時 …… 時刻點各采血一次 ， 一直采到低于有效血藥濃度以下 ， 再繼續(xù)采集 12個血樣 。 采血時間：采血時間與間隔因藥物的品種、動物的品種、用藥途徑不同而不同。 （ 四 ） 樣品采集 藥物動力學收集體液的樣品通常為全血樣品 、 血清樣品 、 或血漿樣品 。 做反芻動物瘤胃控釋劑藥動學試驗時 ， 為了使藥劑不會因反芻過程回到口腔或進入第二胃 、 第三胃 ， 要求控釋劑的裝置要有一定的比重 ， 實踐證明 ， 如果控釋劑的比重為 ， 則是安全的 。 對于不溶性的藥物進行內(nèi)服給藥時 ， 可將藥物加助懸劑 （ 如淀粉 、 醋酸羧甲基纖維素等 ） 制成混懸液投服 。 在內(nèi)服給藥時 ， 對哺乳動物可采用臨床用藥方式進行灌服給藥 ， 或者是通過胃導管投服給藥 ， 后者給藥是將藥物直接投入瘤胃中或單胃動物的胃中 。 作肌內(nèi)注射和口服給藥時 ， 配制的藥液濃度盡可能與常規(guī)用藥條件一致 ， 注意減少因濃度過高或濃度過低造成對吸收的影響 。 如果是作靜脈輸液 ， 用藥則需選用較大的體積 。 否則 ， 要重新選用動物再試 。 從生理學角度分析 ， 血液在體內(nèi)循環(huán)一周所需要的時間約為 1分鐘 。 通常要求快速靜注的藥液體積要小 。即表示要將一定體積的藥液注射到血管內(nèi)，在血液中可形成一個假想的 “ 液丸 ” 。 靜脈給藥通常包括快速靜脈注射和靜脈輸液。 在試驗結果的報告中一定要注明 。 如磺胺嘧啶 ， 包括磺胺嘧啶原粉 （ 酸基部分 ） 和磺胺嘧啶鈉 （ 成鹽成分 ） 。 抗生素的稱量換算：如要稱取硫酸新霉素 100萬 IU， 已知該批產(chǎn)品的效價為 653IU/mg。 ④ 直接采用重量單位表示 。 ③ 少數(shù)抗生素由于重量單位不確仍用 IU表示 。 目前抗生素制品的劑量表示方式有如下幾種： ① 制劑標簽上的標示量直接以國際單位表示 ， 并加注重量單位 ， 如土霉素 25萬 IU， 相當于純堿 250mg。如特定的一批桿菌肽稱重 1mg=55IU。g = 10IU， 1g = 1000萬 IU。 例青霉素單位是以第一次國際標準品青霉素 G鈉稱重