【正文】 段與線性載體嚴格地進行頭對尾連接。（ B） ELPs 單體基因序列的兩端設計成可被兩個限制性內(nèi)切酶 RE1 與 RE2（即分別為 pflM Ι與 BglΙ）識別的序列。但使用重組的方法合成 ELPs 也有一些缺點：由基因編碼的 ELPs 存在 一個很重要的滯后期（ leadtime），這主要是由于需要在理想的載體中對基因進行組裝及需要對宿主細胞進行優(yōu)化表達所導致的 [2]。基因重組合成法更是由于 RDL(recursive directional ligation， RDL)技術 [13]的使用而被推向新的高度，其原理如圖 1 所示。前者的優(yōu)勢是可以在 ELPs 序列特定的位點導入一些非天然氨基酸，但進行大規(guī)模生產(chǎn)卻比較困難。 ELPs的重復序列次數(shù)、濃度、 Xaa、鹽濃度、 pH及分子量是影響類彈性蛋白 tT 主要因素，由于 ELPs是一種對環(huán)境有很大敏感性的生物高分子，影響類彈性蛋白 tT 還有其它多種因素。這一趨勢可以這樣解釋：由于 pH增加，谷氨酸的 γ羧基團逐漸開 始去質(zhì)子化，去質(zhì)子化導致其極性的增強，結(jié)果使得 Tt向更高的溫度轉(zhuǎn)變，以上這些因素主要取決于 ELPs的親疏水性，而在帶電的羧酸根附近不可能有這種水合狀態(tài)（ hydration mode）。因而，如果 ELPs鏈比較短時，就降低了聚合物鏈內(nèi)部疏水性相互作用的效率，所以絮集作用就受抑制。 ELPs的長度與聚合物的疏水性存在一個平衡，由于受到 ELPs聚合物鏈末端的影響，這種影響對低分子量的 ELPs的效應更大，如果 ELPs分子量越低，疏水性就越小。但有時一些鹽離子可以提高 tT ，例如胍鹽 [15]。根據(jù)經(jīng)驗，每增加 1M的 NaCl濃度， tT 就相應地減少 15℃左右。C，這是因為 ELPs–[KV2F]家族的賴氨酸含量比 ELPs–[KV7F]家族高 2倍以上。 Xaa 對 Tt的影響 Lim D W等 [15]在 Xaa中選取可電離的 Lys，與疏水的 Phe相比，前者可以提高 ELPs的鹽敏感度以降低 ELPs的 tT 。 Meyer D E等 [14]分析 ELP[V5A2G3]文庫的 tT 與 ELPs濃度關系時，結(jié)果表明： tT 隨著 ELPs濃度的上升而下降，并且呈線性關系。 影響 Tt 的各種因素 重復序列次數(shù)、濃度對 Tt影響 Meyer D E等 [13]利用遞歸定向連接 (recursive directional ligation， RDL)技術，成功地表達出三種不同單體類彈性蛋白文庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ELPs的 tT 可作為其五肽重復序列次數(shù)的函數(shù)。在相變發(fā)生時，增加溫度會使在水環(huán)境中的聚合物有序性得到加強，而包圍在疏水性殘基的有序水分子變成無序狀態(tài)，此時疏水性基團將與水溶液相分離，結(jié)果在整個變化過程中是趨于無序性的，這與熱力學第二定律相吻合 [1011]。 Urry 從振動熵的形成及疏水性聚集兩方面來闡述 (GVGVP)n 的相變機理。從構(gòu)象變化上， Urry認為（ VPGVG）重復單元在 ProGly處結(jié)構(gòu)為 β轉(zhuǎn)角（ β turn），而重復的 β轉(zhuǎn)角形成右手螺旋的 β螺旋（ righthanded helix termedβspiral），而 β螺旋可用來解釋 tT 效應與 △ tT 機理（ tT effect與 △ tT mechanism）；在分子水平上，當溫度高于 tT 時，部分較為伸展且無序的構(gòu)象轉(zhuǎn)變成較為緊湊的 β螺旋 [56]。相反，當溫度高于 時，該含水的多肽鏈結(jié)構(gòu)就瓦解，并開始聚集，形成一個富含 ELPs 的聚集物。其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復序列單元構(gòu)成，即（ ValProGlyXaaGly, VPGXG），源自于彈性蛋白的疏水區(qū)域，其中 Xaa 可以是除 Pro 以外任一氨基酸 [1]。 molecular dynamics simulations 。 關鍵詞： 類彈性蛋白多肽，相變溫度，非色譜純化，分子動力學模擬，相變機理 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 II Abstract Elastinlike polypeptides (Elastinlike polypeptides, ELPs) are elasticity and environmentally responsive biopolymers. Due to their reversible phase transition characteristic, Elastinlike polypeptides (ELPs) have been used for a number of applications, such as protein purification, drug delivery, and tissue engineering. For the ELPs, the transition temperature ( tT ) is the most convenient parameters for quantificational description of the ELP properties. It is of great importance to explore the relationship between the transition temperature and the sequence characteristics, the number of Xaa of each monomer and the concentration of ELP. The best order of the correlation coefficient for pseudoamino acid position was obtained by using Least Median of Squares Regression from sequence. The uniform design was used to optimize the running parameters and leaveone out crossvalidation was carried out to evaluate the model of back propagation neural work (BPNN) and support vector machines, respectively. The results showed that the predicted model obtained by BPNN was the best, of which the mean absolute error and root mean squared error was ℃ and ℃ , respectively. Then, we de novo designed a novel ELPs gene and cloned it into the modified expression vector pET22b. Then, we transformed the rebinant expression vector pET22bELPs into Escherichia coli BL21(DE3). Upon induction by Isopropyl βDThiogalactoside (IPTG), ELPs was expressed and purified by a nonchromatographic purification method named inverse temperature cycling. The influences of salts types and concentrations on ELPs were also determined. The results showed that the transition temperature of the ELP[KV8F20] decreased to 19℃ by mmol/L Na2CO3. Due to its small molecular weight and sensitivity to salt, the ELPs might be a useful purification tag, which can provide a reliable and simple nonchromatographic method for purification of the rebinant protein by inverse transition cycling. Finally， we concerned on the molecular mechanism for ITT(Inverse temperature transition) of ELPs(elastinlike peptides)， and prediction for the transition temperature of ELP[KV8F20]. As the temperature increased, ELPs undergoes changing from a extended to folded conformation. Molecular dynamic simulations were performed 9ns in explicit water and 1M NaCl solution for ELP[KV8F20] at five different temperature between 300 K and 400 K. During simulation processing, ELP[KV8F20] had hydrophobic collapse in explicit water and 1M NaCl solution. According to simulation result,we concluded that 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 III ELP[KV8F20] had undergone phase transition at the 375K and suffered from denaturalization at 400 K when the ELP[KV8F20] was in inaqueous solutions。 本論文完成了一次從 ELPs 的相變溫度預測到基因的從頭合成并表達的過程，考察不同種鹽對 ELP[KV8F20]相變溫度 的影響 .使用 NAMD 對 ELP[KV8F20]進行分子動力學模擬，并與實驗結(jié)果結(jié)合，完成了一次 ELPs 相變機理及鹽離子降低相變溫度機理的探討。 通過分析，推斷疏水作用與結(jié)合水的減少在 ELP[KV8F20]的相變過程中起到關鍵作用。 在 300K~400k 間 5個不同的溫度下，對 ELP[KV8F20]在水溶液與 1M 的 NaCl 溶液各進行 9ns 的模擬。 通過分子動力學模擬探討類彈性蛋白 ELPs 發(fā)生可逆相變 (ITT， inverse temperature transition)的分子機理及預測 ELP[KV8F20]的相變溫度。結(jié)果表明： mM 的 Na2CO3 能使 25181。將偽氨基酸組成中的的相關系數(shù)部分作為類彈性蛋白的特征向量，從類彈性蛋白序列出發(fā)，利用最小中位方差回歸，找出其序列相關系數(shù)的最佳階數(shù)。 論文作者簽名： 指導教師簽名： 簽 名 日 期： 簽 名 日 期： 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 Dissertation Submitted to the Academic Degree Committee of Hua Qiao University Molecular design, nonchromatographic purification and dynamics simulations of elastinlike peptides By Kaizong Huang In Candidacy for the Master’s Degree of Biochemistry and Molecular Biology Supervised by Assistant Professor Guangya Zhang Hua Qiao University November 2020 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 I 摘要 類彈性蛋白多肽 (Elastinlike polypeptides， ELPs)，是一種非常重要的具有彈性功能的，且對環(huán)境溫度有很大敏感性的生物高分子，利用類彈性蛋白的可逆相變特性，使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應用。本人依法享有和承擔由此論文所產(chǎn)生的權(quán)利和責任。華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 碩士學位論文 類彈性蛋白的分子設計、非色譜純化及分子動力學模擬 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 原創(chuàng)性聲明 本人聲明茲呈交的學位論文是本人在導師指導下完成的研究成果。論文寫作中不包含其他