【正文】 ............... 21 重組克隆質(zhì)粒與表達(dá)載體的雙酶切 ................................................................... 21 ELPs[KV8F20]的表達(dá)與純化 ................................................................................. 23 結(jié)果與討論 .................................................................................................................. 26 pUC19ELPs 的酶切及 ELPs 基因片段回收 ........................................................ 26 ELP[KV8F20]的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 .......................................................................... 27 ELP[KV8F20]相變溫度的影響因素考察 .............................................................. 27 本章小結(jié) ...................................................................................................................... 31 第四章 類彈性蛋白多肽的分子動(dòng)力學(xué)模擬 ................................................................. 32 NAMD 模擬方法 ........................................................................................................ 32 NAMD 軟件 ............................................................................................................. 32 基本流程 ................................................................................................................... 32 結(jié)果分析方法 ........................................................................................................... 33 研究內(nèi)容與意義 .......................................................................................................... 33 ELPs[KV8F20]的 MD 模擬的建立 ........................................................................ 34 動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果與分析 ......................................................................................... 36 RMSD 值分析 .......................................................................................................... 36 氫鍵數(shù)目分析 .......................................................................................................... 38 末端距值分析 .......................................................................................................... 42 溶劑可及性表面積分析 ........................................................................................ 43 本章小結(jié) ...................................................................................................................... 45 第五章 結(jié)論 ...................................................................................................................... 46 第六章 研究展望 ............................................................................................................. 47 參考文獻(xiàn) ............................................................................................................................ 48 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況 ........................................................................... 52 致謝 .................................................................................................................................... 53 附圖 .................................................................................................................................... 54 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 1 第一章 緒論 類彈性蛋白多肽的概述 類彈性蛋白多肽簡(jiǎn)介 類彈性蛋白多肽 (Elastinlike polypeptides， ELPs)是一種具有彈性功能且對(duì)環(huán)境溫度非常敏感的人造基因工程蛋白質(zhì)聚合物。 ELPs 有一個(gè)可逆相變過程，稱之為反轉(zhuǎn)變溫度（ inverse temperature transition， ITT），若環(huán)境溫度低于該相變溫度（ transition temperature， tT ），該多肽在水溶液中為高度可溶，聚合物鏈保持無序結(jié)構(gòu)，且相當(dāng)伸展。 利用類彈性蛋白的可逆相變特性 ,使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應(yīng)用 [2] 類彈性蛋白多肽的相變機(jī)理 相變過程是 ELPs在水溶液中絮聚的過 程，伴有伸展型多肽鏈的瓦解并與溶液相分離 [34]。 Dybal [7]認(rèn)為發(fā)生相變時(shí)，在 Pro與 Val殘基處會(huì)形成 β(II)轉(zhuǎn) 角；但 Gross [8]等認(rèn)為，在整個(gè)相變的過程中，聚合五肽 (GVGVP)n并不存在 β螺旋構(gòu)像，而 β折疊（ β sheets）則是其最基本的規(guī)則構(gòu)象（ the basic regular part of conformation）； Serrano等 [9]研究表明升高溫度會(huì)使得 β螺旋聚集在一起，在 1℃ 的相變溫度范圍內(nèi)，他們觀測(cè)到有 25％的氨基酸在鏈內(nèi)形成了 β折疊。在(GVGVP)n 疏水區(qū)域內(nèi)有序體運(yùn)動(dòng)鏈節(jié)會(huì)產(chǎn)生相互作用， 由于疏水區(qū)域內(nèi)部運(yùn)動(dòng)鏈華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 2 的阻尼作用，疏水性區(qū)域聚集會(huì)引起振動(dòng)熵的上升，疏水性區(qū)域聚集的發(fā)生是伴隨著蛋白疏水部位共振，而溫度在一定范圍內(nèi)上升時(shí)有助于疏水作用加強(qiáng)。 從能量變化角度來看，相變過程是一個(gè)復(fù)雜多步的轉(zhuǎn)變，在該轉(zhuǎn)變過程中，某些步驟是吸熱的，這可能與疏水性水合作用的損耗有關(guān)；而其它步驟均是放熱的，結(jié)果導(dǎo)致 ELPs 多肽鏈以物理方式（范德華力）聚集在一起，但在這一過程中 ELPs放熱組份數(shù)量還不及吸熱組份數(shù)量三分之一 [12]。當(dāng)五肽重復(fù)序列次數(shù)較少時(shí)， ELPs的 tT 隨重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)的增加而下降較明顯，當(dāng)五肽重復(fù)序列 次數(shù)較大時(shí)， ELPs的 tT 隨重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的增加，其值變化不大。即 bCmTt ?? )ln( ， m 代表斜率，ELPs單體不同，其值也不相同， C 為 ELP濃度。通常情況下，相似分子量的 ELPs–[KV2F]家族的 tT 比 ELPs –[KV7F]家族要高 16～ 42176。 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 3 鹽濃度對(duì) Tt的影響 對(duì)于所有的 ELPs， tT 均隨 NaCl濃度增加而下降。然而，這種影響效應(yīng)會(huì)隨著 ELPs分子中帶電氨基酸的不同而變化，在溶解液中， ELPs的 tT 的離子效應(yīng)遵循 霍夫邁斯特離子 序(Hofmeister series)。 分子量對(duì) ELPs 的 Tt影響 Girotti A等 [16]對(duì)一系列的 ELPs模型進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著分子量下降， ELPs的 tT卻逐漸上升。然而，這種鏈末端的極性并不能有效說明這一情況， Girotti A認(rèn)為，分子量對(duì) tT 的影響更大部分取決于聚 合物鏈內(nèi)疏水性相互作用而產(chǎn)生的絮集作用。 pH 對(duì) Tt的影響 Girotti A等 [16]通過實(shí)驗(yàn)表明，在相同 ELPs濃度下，ELPs[(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)2]n（ n分別為 5， 9， 15， 30， 45），它們的 tT 均顯示出相同的趨勢(shì)：當(dāng)?shù)陀谀骋粋€(gè)給定的 pH時(shí)， tT 值幾乎保持常數(shù)，當(dāng)高于這一特定的 PH值時(shí)， tT 就迅速增加。 其它與 Tt有關(guān)的因素 ELPs[KV2F8] 和 ELPs[KV7F9]，分別只有 40和 45個(gè)氨基酸，是到目前為止最短的 ELPs純化標(biāo)簽，這兩種 ELPs（ free ELPs）是不能通過反相轉(zhuǎn)換循環(huán) (Inverse 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 4 transition cycling ITC)純化出來，但這兩種 ELPs的融合蛋 白是可以通過 ITC被提純的，因?yàn)? ELPs的融合蛋白的 tT 比純粹的 ELPs（ free ELPs）的 tT 低 [14]。 類彈性蛋白多肽的合成方法 ELPs 合成方式主要有兩種：一種是化學(xué)法，另一是基因重組合成法，后者為目前主流方法。與化學(xué)合 成法相比，使用基因重組合成法具有以下優(yōu)勢(shì)：可通過基因模板控制 ELPs 序列、立體化學(xué)、分子量；且 ELPs 的轉(zhuǎn)化菌株可以永久性生產(chǎn) ELPs；細(xì)胞內(nèi)折疊機(jī)制可幫助 ELPs 折疊成正確的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu) [2]。使用基因重組合成法，并通過一系列條件優(yōu)化后， ELPs 的純化產(chǎn)量可達(dá) 克 /升 [17]。 圖 RDL 技術(shù)的分子生物學(xué)步驟 [13] The molecular biology steps of RDL[13] 華僑大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文 5 （續(xù)圖 ）（ A）人工合成的 ELPs 單體基因插入到克隆載體中。（ C）分別用 RE1與 RE2 的限制性內(nèi)切酶酶切含有 ELPs 基因的克隆載體，產(chǎn)生含有 RE1 與 RE2 酶切后粘性末端的片段；用 RE1 酶切含有 ELPs 克隆載體，產(chǎn)生線性克隆載體。（ E）通過此方式，進(jìn)行新一輪的 ELPs 基因序列延長 [13]。當(dāng) ELPs 與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)， ELPs 融合蛋白也有可逆階段，這使得通過 ITC 開發(fā)一種非層析法來純化融合蛋白成為可能。 表 五種純化方法成本比較 Tabl e The cost of five purification methods 項(xiàng)目 pMAL fusion w/tag removal Histag w/ tag removal IMPACTCN PHB 純化體系 ELPs 純化體系 常規(guī)產(chǎn)量 40 Mg/L 74 Mg/L Mg/L 36 Mg/ 85 Mg/L 樹脂吸附力 3 Mg/ml 8 Mg/ml 2 Mg/ml — — 生長培養(yǎng)基 ＄ 44, ＄ 23, ＄ 379，