【正文】 人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究內(nèi)容，如參考他人或集體的科研成果，均在論文中以明確的方式說明。 學位論文作者簽名： 日期： 學位論文版權使用授權聲明 本人同意授權華僑大學有權保留并向國家機關或機構送交學位論文和磁盤，允許學位論文被查閱和借閱。 ELPs 的相變溫度是定量描述其相變溫度性質(zhì)最便利的參數(shù)，通過相變溫度實測值探討與其序列組成、每一單體的 Xaa 數(shù)量、濃度等因素間的關系具有重要意義。運用均勻設計分別對支持向量機與 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡參數(shù)進行優(yōu)化 ，并進行交叉驗證，結果表明 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡獲得的預測模型最佳，其絕對誤差為 ℃，均方根誤差為 ℃ . 從頭設計了類彈性蛋白多肽的序列并人工合成其編碼基因片段，克隆至改造后的表達載體 pET22b 中，構建重組表達載體，轉化于大腸桿菌 BL21(DE3)中并誘導表達，采用可逆相變循環(huán)經(jīng)高速離心對其進行純化，利用 SDSPAGE 與色氨酸標準曲線對 ELPs 進行分析與定量，并考察了五種陰離子與三種陽離子及濃度對類彈性蛋白相變溫度的影響。M ELP[KV8F20]相 變溫度降低至 19℃，此 ELPs 序列有望開發(fā)成一新型純化標簽，為今后重組蛋白的非色譜分離純化奠定基礎。隨著溫度的升高，類彈性蛋白經(jīng)歷可逆相變，由舒展的構象過渡到折疊構象 。模擬過程中， ELP[KV8F20] 在水溶液與 1M 的 NaCl 溶液均發(fā)生疏水縮聚， 推斷在水溶液條件下， ELP[KV8F20]在 375K 時發(fā)生相變， 400K 時 ELPs 已經(jīng)變性；在水溶液條件下， ELP[KV8F20]在 350K 時發(fā)生相變， 375K 時 ELPs 已經(jīng)變性。此外，比較不同溫度下蛋白的縮聚程度，并結合實驗結果，推斷出蛋白的相變溫度在102℃左右?？偨Y了相關結論，這可為今后利用 ELPs 純化重組蛋白提供經(jīng)驗積累和理論依據(jù)。 ELP[KV8F20] had undergone phase transition at the 350K and suffered from denaturalization at 375 K when the ELP[KV8F20] was in 1M NaCl solutions. We believed that hydrophobic collapse and decreasing quantity of binational water played a key role for ITT. At addition,analysed degree of hydrophobic collapse at different temperature,and bining with experiment result,which indicated the transition temperature for ELP[KV8F20] is about 102℃ . In this paper, we pleted predicting the transition temperature of ELPs, and de novo synthesis and expressed a ELPs gene (ELP[KV8F20]), determined effection of different kinds of salt on transition temperature for ELP [KV8F20]. Did molecular dynamics simulations on the ELP[KV8F20] by NAMD, whose result bined with experimental results, discussed mechanism that the ELPs undergone Inverse temperature transition and decreased transition temperature by NaCl. Our results can provide the theoretical basis of experience about using ELPs tag to purify the rebinant protein. Keywords: elastinlike peptides ； transition temperature ； nonchromatographic purification。transition principle華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 IV 摘要 ....................................................................................................................................... I ABSTRACT ....................................................................................................................... II 第一章 緒論 ...................................................................................................................... 1 類彈性蛋白多肽的概述 ............................................................................................... 1 類彈性蛋白多肽簡介 ................................................................................................. 1 類彈性蛋白多肽的相變機理 ..................................................................................... 1 影響 Tt 的各種因素 .................................................................................................... 2 類彈性蛋白多肽的合成方法 ..................................................................................... 4 類彈性蛋白多肽的應用 ............................................................................................. 5 動力學模擬方法的應用 ............................................................................................. 8 課題來源及研究意義 ................................................................................................... 9 第二章 使 用偽氨基酸組成和 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡預測類彈性蛋白多肽的相變溫度 .......... 10 引言 .............................................................................................................................. 10 實驗材料 ...................................................................................................................... 10 數(shù)據(jù)來源與預測工具 ............................................................................................... 10 結果與分析 .................................................................................................................. 12 氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)的選擇 .............................................................................. 12 利用支持向量機預測相變溫度 ............................................................................... 13 利用神經(jīng)網(wǎng)絡預測相變溫度 ................................................................................... 15 小結 .............................................................................................................................. 16 第三章 類彈性蛋白多肽的從頭設計、非色譜純化及鹽 效應研究 ............................. 17 ELPS[KV8F20]的表達策略 ...................................................................................... 17 ELPs 的命名 ............................................................................................................. 17 表達載體及宿主的選擇 ........................................................................................... 17 表達質(zhì)粒 pET22b[KV8F20]的構建 ..................................................................... 18 實驗材料 ...................................................................................................................... 18 菌種和質(zhì)粒 ............................................................................................................... 18 培養(yǎng)基 ....................................................................................................................... 19 工具酶、 DNA Marker 和試劑盒 ............................................................................ 19 主要試劑 ................................................................................................................... 19 主要儀器 ................................................................................................................... 20 試劑的配制 ............................................................................................................... 20 實驗方法 ...................................................................................................................... 21 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 V ELP[KV8F20]的克隆 ...............................................................................