【正文】 為緩沖劑或同時可作為營養(yǎng)源。 4，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分 （ 1） 水 （ 2） 碳源 ? 影響選擇碳源的因素 ： ? 原料成本占生產(chǎn)總成本的比例； ? 在某些發(fā)酵過程中，必須除去碳源中的雜質(zhì)； ? 對碳源的選擇，往往還受到政府政策的影響； ? 當(dāng)?shù)氐姆蓷l例指定了許多飲料業(yè)所使用的底物； ? 培養(yǎng)基的配制方法，特別是滅菌方法。在分批補(bǔ)料發(fā)酵時，則 26％的葡萄糖用于生長、 70％用于維持生命、 6％用于合成青霉素。解方程式．得： 按上述方程式計(jì)算每 1g 葡萄糖能產(chǎn)生 芐青霉素的理論值。 Cooney(1979)以青霉素生物合成的途徑為基礎(chǔ)，通過物質(zhì)和能量平衡，計(jì)算出青霉素生物合成的理論值。將碳源轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的觀察值與理論上最大值之間進(jìn)行比較，才能進(jìn)行深入的研究。為要獲得 30gdm3 濃度的細(xì)胞，需要葡萄糖 30／ ＝ 60gdm3。 該系數(shù)的定義是：細(xì)胞干物質(zhì)的產(chǎn)量／碳源底物的被利用量 下表中列出了一些 Yx/s 值。一旦測出其中一種是生長因子，就要在培養(yǎng)基中加入適量的純凈的化合物或含有該物質(zhì)的混合物。在許多培養(yǎng)基中增加磷酸鹽濃度，其用意是增加培養(yǎng)基的緩沖容量，這一點(diǎn)，在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時要引起注意。 （ 2）組成微生物的元素包括 C、 H、 O、 N、 S、 P、 Mg 和 K（見下表），這些元素都要在方程式中予以平衡 細(xì)菌、酵母和真菌的元素組成 (按干重％計(jì) ) 在培養(yǎng)基中有些元素的含量往往超過需要量，如 P和 K。 這些培養(yǎng)基的組份的數(shù)量僅僅是供給細(xì)胞形成產(chǎn)物，而不包括生成細(xì)胞所需的營養(yǎng)。 3，如何進(jìn)行培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) （ 1）作出細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的化學(xué)計(jì)算的平衡 碳源和能源 +氮源 +其他需要→細(xì)胞 +產(chǎn)物 +CO2+H2O++熱量 通過計(jì)算可以獲得生產(chǎn)一定數(shù)量的細(xì)胞時所需的營養(yǎng)物的最低數(shù)量。而發(fā)酵培養(yǎng)基是否適合于菌體的生長或積累代謝產(chǎn)物，對最終產(chǎn)品的得率具有非常大的影響。 三、工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) 1，為何要進(jìn)行培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)？ 完善的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)工廠和生產(chǎn)規(guī)模的放大中的一個重 要步驟。一些 發(fā)酵 廠如采用玉米作為原料，總是把玉米坯芽除去。蛋源一般包括有機(jī)蛋源和無機(jī)氮源兩種，根據(jù)不同情況，添加不同種類的氮源。一般的說，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)氮的含量適當(dāng)，則 微生物 生長旺盛，酶的含量也較高。纖維素雖屬于碳水化合物，但不被淀粉水解，只起填充作用，對于發(fā)酵沒有什么直接影響。常用原料中主要的化學(xué)成分如下： 碳水化學(xué)物 ： 原料中所含的淀粉，或與淀粉類似的菊糖、蔗糖、麥芽糖、果糖及葡萄糖等，這些物質(zhì)都可以發(fā)酵生成 產(chǎn)品 ，同時也是霉菌和酵母的營養(yǎng)及能源，原料中含這 些物質(zhì)越多，生成酒精也就越多，所以它和產(chǎn)量有著密切的關(guān)系。 4， 農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物 米粞、米糠餅、麩皮、高粱糠、淀粉渣等。 2， 糧谷類 ： 高粱、玉米、大米、谷子、大麥、小麥、燕麥、黍和稷等。 （ 3）培養(yǎng)基的組成，除了考慮到菌體生長和產(chǎn)物的形成的需要外，還要考慮到培養(yǎng)基的 pH 變化、泡沫的形成、氧化還原電位和微生物的形態(tài)等，而且還有前體和代謝抑制劑的需要。同樣的理由，在一個巳設(shè)定的發(fā)酵罐中，發(fā)酵必然會受到培養(yǎng)基組份改變的影響。 2， 在確定原料選擇原則時需注意的問題 （ 1）所選用的培養(yǎng)基與所使 用的發(fā)酵器的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 此外，還應(yīng)當(dāng)考慮到大力節(jié)約糧食原料，盡量少用或不用糧食原料，充分利用當(dāng)?shù)氐姆羌Z食原料，廣泛利用野生植物原料，同時利用農(nóng)林副產(chǎn)物和植物纖維原料，以及亞硫酸鹽紙漿廢液等，對于節(jié)約糧食原料有著重要意義。 （ 5）對人民的身體無尋損害，影響發(fā)酵過程的雜質(zhì)含量因應(yīng)當(dāng)極少，或者幾乎不含。 （ 4）原料要容易貯藏。 （ 3）原料資源要豐富，容易收集。對于工業(yè)上大規(guī)模投入生產(chǎn)的原料，除了要提出工藝上的要求外，還要提出生產(chǎn)管理和經(jīng)濟(jì)上的要求，因此，在選擇工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)酒精的原料時，應(yīng)考慮到下列諸條件： （ 1）因地制宜，就地取材，原料產(chǎn)地離工廠要近，便于運(yùn)輸，節(jié)省費(fèi)用。 第四章 培養(yǎng)基及其制備 第一節(jié) 原料 一 、 原料的 定義及選擇 （一）原料的定義 從工藝角度來看，凡是能被生物細(xì)胞利用并轉(zhuǎn)化成所需的代謝產(chǎn)物或菌體的物料，都可作為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的原料。紅螺菌科中醌鐵復(fù)合體的氧化還原電位不夠低，不能直接還原 NAD+，它們是通過環(huán)式電子傳遞 產(chǎn)生 ΔP，再由 ΔP推動從琥珀酸到 NAD+的電子逆轉(zhuǎn)，以還原 NAD+為 NADH。當(dāng)其在氫中生長時，可以利用分子氫直接還原NAD(P)+為 NAD(P)H。其過程可分為五步：（ 1）光的吸收，紫色細(xì)菌通過光捕獲復(fù)合體 (Bchl 十類胡蘿卜素十 B870)；（ 2）使反應(yīng)中心葉綠素 (P870)處于激發(fā)態(tài) (P*870)；（ 3）電荷分離， P*870 失去一個電子為 P+870，高能電子躍升到電子受體細(xì) 菌脫鎂葉綠素 (Bph)形成 Bph；（ 4）電子沿醌鐵蛋白 (QFe)， Q 細(xì)胞色素 b 到 C 2 順序移動，電子在細(xì)胞色素 b 至 C2 時偶聯(lián)磷酸化產(chǎn)生 ATP；（ 5）低能電子返回到 P+870 形成 P870，然后整個系統(tǒng)又接受光量子重復(fù)上述過程。 紫色細(xì)菌的光能轉(zhuǎn)化 紫色細(xì)菌的光能電子傳遞見下圖。前者是指光化反應(yīng)階段，后者是指暗反應(yīng)階段。在光合細(xì)菌中，光合作用還原 CO 2 的電子是來自還原型無機(jī)硫、氫或有機(jī)物，沒有氧的釋放，把這種類型的光合作用稱為非放氧型光合作用。在植物、藻類和藍(lán)細(xì)菌的光合作用中，還原 CO2 的電子是來自水的光解，并有氧的釋放。這種固定 CO2方式的特點(diǎn)是 CO2 被固定在某種有機(jī)物 (主 要是有機(jī)酸 )中，結(jié)果是加長了碳鏈，使來自 CO2的碳原子也可用于某些物質(zhì)的生物合成。還有 CO2 和 NH3在氨甲酰磷酸合成酶催化下，生成氨甲酰磷酸，作為合成 UMP 的起始物或參與瓜氨酸的合成。 此外，在脂肪酸合成 中也有固定 CO2 的反應(yīng)，如乙酰 CoA 在乙酰 CoA 羧化酶的催化下生成丙二酰 CoA，此反應(yīng)得要生物素和 ATP。三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物的消耗 (用于生物合成 )，可由這些固定作用加以補(bǔ)充。 6，異檸檬酸脫氫酶：它催化 α酮戊二酸還原羧化成異檸檬酸，需要 NAD(P)H2。催化這類反應(yīng)的酶有以下幾種： 1，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶：它催化磺酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸并產(chǎn)生無機(jī)磷酸． 2，磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶：它催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，同時使 ADP 轉(zhuǎn)為 ATP 3，磷酸烯醇式丙酮酸羧基轉(zhuǎn)磷酸化酶：它所催化的反應(yīng)與②相同，但需要二碳酸和無機(jī)磷酸，后者本身能變成焦磷酸． 4，丙酮酸羧化酶： 它催化丙酮酸羧化成草酰乙酸，并使 ATP 轉(zhuǎn)化成 ADP 和 Pi，反應(yīng)中還需要生物素。假如 TCA 環(huán)中的中間產(chǎn)物被用作生物合成的原材料，那么就必須加以補(bǔ)充，才能維持 TCA 的正常運(yùn)行。 （二）異養(yǎng)型 CO2固定 異養(yǎng)型 CO2的固定主要是合成 TCA 環(huán)的中間產(chǎn)物。 另外還有還原的三羧酸環(huán)和還原的單羧酸環(huán)兩條途徑，感興趣的同學(xué)可參閱相關(guān)參考書。而 1mol 葡萄糖被徹底氧化時會放出約。因此，每合成一分子葡萄糖，需要固定 6 分子 CO2，消耗 l8 分子 ATP和 12 分子 NADPH2，總反應(yīng)式為： 6CO2+18ATP+12NAD(P)H2 C6H12O6+18ADP+18Pi+12NAD（ P） ATP 和 NAD(P)H2被稱為同化力，在光合生物中是靠光能形成的，在無機(jī)自養(yǎng)細(xì)菌中則靠氧化無機(jī)物獲得。為此需要 6 分子 1， 5二磷酸核酮糖分別作為 CO2 的受體，共生成 12 分子 3磷酸甘油酸 ，在此羧化階段，并不消耗能量。由于這些酶存在，保證卡爾文能沿合成方向運(yùn)行。 1， 5二磷酸核酮糖的再生，是卡爾文環(huán)的 特有反應(yīng)，它的再生需要能量，是不可逆反應(yīng)，需要 5磷酸核酮糖激酶催化。 由上述一系列反應(yīng)所生成的 7磷酸景天庚酮糖在轉(zhuǎn)酮酶催化下與另一分子 3磷酸甘油醛反應(yīng)，生成 5磷酸木酮糖和 5磷酸核糖， 5磷酸核糖經(jīng)異構(gòu)化生成 5磷酸核酮糖， 5磷酸木酮糖經(jīng)表異構(gòu)化也生成 5磷酸核酮糖。所生成的 4磷酸赤蘚糖，在醛縮酶催化下，與另一分子磷酸二羥丙酮縮合成 l， 7二磷酸景天庚酮糖。另一部分則轉(zhuǎn)化 (異構(gòu) )為磷酸二羥丙酮，后者再與另一分子 3磷酸甘油醛縮合成 l， 6二磷酸果糖，并經(jīng)水解脫磷酸生成 6磷酸果糖。這也是細(xì)胞如何將生 物合成與降解途徑分開的一個手段。在糖酵解反應(yīng)中是以 NAD 為輔酶，所催化的反應(yīng)是降解與氧化；而在二磷酸核酮糖環(huán)中是以 NADPH2 為輔酶，所催化的反應(yīng)是生物合成與還原。還原過程包括兩步反應(yīng)： 反應(yīng)中 ATP 和 NADPH2 是必需的，前者參與活化羧基的磷酸化反應(yīng)，后者實(shí)際上是自身還原。 3P甘油酸是 CO2固定過程中的第一個穩(wěn)定中間產(chǎn)物。 經(jīng)卡爾文循環(huán)固定 CO2的過程可分為三個階段： 羧化階段：也就是 CO2 的固定階段，該反應(yīng)是在二磷酸核酮糖羧化酶催化下，以 l， 5— 二磷酸核酮糖作為 CO2 的受體，生成一個 6 碳的中間化合物，此化合物不穩(wěn)定，隨即水解成二分子 3— 磷酸甘油酸。 二磷酸核酮糖環(huán) ：這個途徑最初是由卡爾文 (Calvin)等研究綠藻的光合作用時查明的，所以又稱 為卡爾文環(huán)。代表性菌株： Rubrivivax gelatinosus CBS （ 96mmol H2/mg cdw/h）。 （ 4）光合異養(yǎng)微生物水氣轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)生氫氣 一些光合異養(yǎng)微生物在暗條件下能夠利用 CO 做為 單一碳源，產(chǎn)生 ATP 的同時釋放出H CO2 CO(g) + H2O(l) → CO2(g) + H2(g) ① Rubrivivax gelatinosus CBS 不僅可以 在暗條件下進(jìn)行 CO水 氣轉(zhuǎn)換反應(yīng)，而且能利用光能固定 CO2 將 CO 同化為細(xì)胞質(zhì)；即使在有其 他有機(jī)底物的情況下，其也能夠很好利用CO ② Rubrivivax gelatinosus CBS 能夠 100%轉(zhuǎn) 換氣態(tài)的 CO 成 H2。 產(chǎn)氫速率為： mmol H2/L ,100h. （ 2）間接光解產(chǎn)氫（藍(lán)細(xì)菌） 藍(lán)細(xì)菌主要分為：藍(lán)綠藻、藍(lán)藻綱類、藍(lán)藻類 總反 應(yīng)式為： 12H2O + 6CO2 Light energy C6H12O6 +6O2 C6H12O6 + 12H2O Light energy 12H2 +6CO2 代表性菌（藻）株： Anabaena variablilis（ umol H2/mg chla/h） （ 3）光發(fā)酵產(chǎn)氫（無硫紫細(xì)菌） 無硫紫細(xì)菌在缺氮條件下，用光能和還原性底物產(chǎn)生氫氣 : C6H12O6 + 12H2O Light energy 12H2 + 6CO2 代表菌株為： Rhodospirillum rubrumL（ 180 ml H2/L of culture/h）； （ L H2/L or immobilized culture/h）。 PSII 抑制劑，如： DCMU、CCCP、 FCCP。 氫化酶是氫細(xì)菌進(jìn)行無機(jī)化能營養(yǎng)方式生長的關(guān)鍵酶，通過誘變使氫細(xì)菌中的 Hase 缺失，這種菌株在 O2 和 H2的系統(tǒng)中利用有機(jī)物而喪失了無機(jī)化能自養(yǎng)的特性，這表明 Hase缺失，使菌體中 NAD(P)+可完全用于脫氫酶的脫氫。由于果糖分解脫下的氫不能交給 NAD(P)+(因消耗于環(huán)境中氫的還原 )故在這種情況下不能利用果糖等有機(jī)物。 (2)果糖經(jīng) ED 途徑分解的關(guān)鍵是進(jìn)行脫氫氧化。共原因有兩方面： (1)果糖的利用是通過 ED 途徑進(jìn)行的。有的還可利用嘌呤和嘧啶進(jìn)行生長。在氧限量時， CoQ 明顯減少，當(dāng)氧過量時， VK2 含量極微。 偶聯(lián)部位以阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)明。另外，它可直接運(yùn)送電子進(jìn)入呼吸鏈，兩種氫化酶的作用及電子傳送途徑見下圖?？扇苄詺浠覆皇?CN、 CO 的抑制。 可溶性氫化酶催化氫的氧化，能直接還原 NAD+，還能還原 Cytb、 Cytc 等，它不與氧、NAD+和甲烯藍(lán)起反應(yīng)，它受 ADP 相 ATP 相對濃 度的控制，當(dāng) ADP 缺少， ATP 過量時，酶的活性受抑制。兩條途徑中都有細(xì)胞色素存在，在許多氫細(xì)菌中還發(fā)現(xiàn)有 CoQ，一般認(rèn)為 ATP 產(chǎn)生是電子從氫傳到細(xì)胞色素 b 的部位，顆粒狀 氫化酶不受過量 ATP 的抑制，但可被 NADH、 CN 利 CO 所抑制。顆粒狀氫化酶結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上，它直接與呼吸鏈偶聯(lián)，不經(jīng)過依賴于 NAD+的脫氫酶作中間體，催化氫的氧化，并把電子直接傳給呼吸鏈產(chǎn)生 ATP。 在多數(shù)氫細(xì)菌中，有兩種氫化酶，其結(jié)構(gòu)和功能各不相同。 在有分子氫和氧的條件下，氫細(xì)菌在生長過程中實(shí)際上包括兩個過程：①分子氫氧化成水，放出能量；②分子氫還原 CO2 成為細(xì)胞物質(zhì)，總的結(jié)果是以 6： 2： l 的比例消耗 H2，O2 和 CO2，其反應(yīng)如下： 四分子氫 氧化成水所放出的能量可產(chǎn)生一分子 ATP，用于還原 CO2 構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和維持細(xì)菌的生長。 嗜石油諾卡氏菌對甲基環(huán)己烷降解 第六節(jié) H2 和 CO2 的微生物代謝 一、 H2的微生物代謝 1，分解代謝 氫細(xì)菌都是一些呈革蘭氏陰性的兼性化能自養(yǎng)菌。實(shí)際上，有幾種微生物可以利用環(huán)己醇生長．如小球諾卡氏菌 (Nocardia globeru