【正文】 示。它們能利用分子氫，氧化產(chǎn)生的能量同化 CO2，也能利用其它有機(jī)物進(jìn)行生長。 氫細(xì)菌的細(xì)胞膜上有泛醌、維生素 K2及細(xì)胞色素等呼吸鏈成分，但與其它的好氧微生物不同，在氫細(xì)菌里，電子直接從氫轉(zhuǎn)移到呼吸鏈，電子再經(jīng)呼吸鏈傳遞產(chǎn)生 ATP，一種不透明的諾卡氏菌 (Nocardia opaca)只含有一種可溶性氫化酶，它可使氫還原 NAD+產(chǎn)生NADH，然后， NADH 再作呼吸鏈的供氨體，產(chǎn)生 ATP。 （ 1）顆粒狀氫化酶 (particulate hydrogenase) 如真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 (A． eutrophus)的顆粒狀氫化酶是由兩個亞基組成的，一個亞基分子量為37000，另一個亞基分子量為 37000，二者之比為 1： 1。電子在呼吸鏈上傳遞可能有兩條途徑：一條是依賴于維生素 K2(VK2)的途徑；另 — 條是與維生素 K2 無關(guān)的途徑。 （ 2）可溶性氫化酶 (so1uble hydrogenase) 真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 (A． eutrophus)的可溶性氫化酶存在于細(xì)胞質(zhì)中，由四聚體復(fù)合組成，其中三個亞基 (分子量分別為 63000、 60000、 29000，摩爾比例為 1： 1： 2，還含有黃素單核苷酸和 FeS 中心 (FMN： Fe： S 摩爾比為 2： 12： 12)。反應(yīng)產(chǎn)物 NADP 對酶也有抑制作用。它的主要功能是為菌體生長提供固定 CO2 的還原力。 真養(yǎng)產(chǎn)堿菌中兩種氫化酶的功能。 Phase（顆粒狀氫化酶）、 Shase（可溶性氫化酶） 在真養(yǎng)產(chǎn)堿菌中，同時含有 CoQ 和 VK2，因培養(yǎng)條件不同，這兩種物質(zhì)的相對濃度則不同。 必須指出，氫細(xì)菌是 — 類兼性化能自養(yǎng)菌，在有 O2無 H2時，可利用糖或有機(jī)酸或氨基酸而生長。 當(dāng)氫細(xì)菌以無機(jī)化能營養(yǎng)方式生長時， H2 的存在能阻抑菌體對有機(jī)物 (如對果糖 )的利用，這種現(xiàn)象稱為氫效應(yīng)。當(dāng)有氧存在時，分子氫使 ED 途徑中酶合成的誘導(dǎo)受到抑制，因而不能利用 ED 途徑分解有機(jī)物，包括果糖。在氫細(xì)菌體內(nèi) NAD(P)+是有限的，當(dāng)有 O 2 和 H 2 時，氫化酶催化生成 NAD(P)H，餃菌體內(nèi) NAD(P)+減少。其實質(zhì)是氫細(xì)菌中的氫化酶與 ED 途徑的關(guān)鍵酶 —— 脫氫酶爭奪體內(nèi)有限的 NAD(P)+，而使生長停止。 2，合成代謝 （ 1）直接光解技術(shù)（綠藻） 在厭氧條件下，綠藻既可以利用氫作為電子供體用于二氧化碳的固定或釋放氫氣 由于氧對氫酶的嚴(yán)重抑制，必須將光合放氧和光合放氫在時間上或空間上分開，可以通過部分抑制 PSII 光化學(xué)活性來實現(xiàn)：元素調(diào)控，如：硫、磷。 代表性藻株有 :Chlamydomonas reinhardtii。已有將這類微生物光發(fā)酵產(chǎn)氫用于處理有機(jī)廢水的實例。 ③ 這類微生物的氫酶具有很強(qiáng)的耐氧性，在空 氣中充分?jǐn)嚢钑r氫酶的半衰期為 21h。 （ 5）暗發(fā)酵制氫 厭氧細(xì)菌利用有機(jī)底物進(jìn)行暗發(fā)酵產(chǎn)生氫氣；溫度范圍 2580℃ ，或超高溫 80 ℃ ① 當(dāng)乙酸為終產(chǎn)物時： C6H12O6 + 2H2O→ 2CH3COOH + 4H2 + 2CO2 ② 當(dāng)丁酸為終產(chǎn)物時： C6H12O6 + 2H2O→ CH3CH2CH2COOH + 2H2 + 2CO2 當(dāng) H CO2 分壓增加，產(chǎn)氫速率明顯降低，合成更多與產(chǎn)氫競爭的底物 二、 CO2 的微生物代謝 Calvin 循環(huán)的三個階段 自養(yǎng)微生物，包括光能自養(yǎng)和化能自養(yǎng)，固定 CO2的途徑有以下三條。二磷酸核酮糖環(huán)是所有光能自養(yǎng)和化能自養(yǎng)微生物所共有的途徑。 在上述反應(yīng)式中，只有一個 3P甘油酸分子中的羧基來自 CO2。 還原階段：被固定在 3P甘油酸分子中的碳原子與 CO2 中的破原子一樣，具有同樣的氧化水 平，只有經(jīng)過還原階段，才能使來自 CO2 的碳原子還原到碳水化合物的氧化水平。應(yīng)該指出，磷酸甘油醛脫氫酶是糖酵解 (BMP)途徑和二磷酸核酮糖環(huán)中所共有的酶。這種差異很重要，因為這樣可以使一個酶在不同條件下催化兩種性質(zhì)不同的反應(yīng)，各自行使功能。 再生階段： CO2 固定所生成的 3磷酸甘油醛，一部分被用于代謝活動或合成己糖。所生成的 6磷酸果糖又和另一分子 3磷酸甘油醛經(jīng)轉(zhuǎn)酮酶催化，生成 5磷酸木酮糖和 4磷酸赤蘚糖。后者經(jīng)磷酸酯酶催化，水解掉 Cl 位上的磷酸基團(tuán)，而生成 7磷酸景天庚酮糖，這是一個不可 逆反應(yīng)，保證卡爾文環(huán)沿合成方向進(jìn)行。這些 5磷酸核酮糖在 5磷酸核酮糖激酶的催化下，都形成 1， 5二磷酸核酮糖，因而 CO2 受體得以再生 (圖 63)，又可接受 CO2，重復(fù)上述一系列的反應(yīng)，最終結(jié)局是將 CO2 同化成為己糖，在此過程中消耗了大量的 ATP 和 NADPH2。 Calvin 環(huán)中 CO2 受體的再生 綜上所述，卡爾文環(huán)中包括了 BMP 和 HMP 途徑中的某些反應(yīng)，但是卡爾文環(huán)有自身的關(guān)鍵酶系，而且這些酶系所催化的反應(yīng)都是不可逆的，它們是 1， 5二磷酸核酮糖羧化酶，1， 7二磷酸景天庚酮糖磷酸酯酶和 5— 磷酸核酮糖激酶。 卡爾文環(huán)每運行一周可將 6 分子 CO2 同化成 1 分子葡萄糖。大量的能量消耗在由 3磷酸甘油酸被還原成 3磷酸甘油醛的還原階段，共計消耗 12 分子 ATP 和 12 分子 NADPH2，在還原階段所生成的 12 分子 3磷酸甘油醛中，有 2分子被用以縮合成 1 分子葡萄糖，其余 10 分子 3磷酸甘油醛與參與 CO2受體分子再生的復(fù)雜反應(yīng)系列，最終又組建成 6 分子的 1， 5二磷酸核酮糖，在這個復(fù)雜的反應(yīng)系列中，除最后一步反應(yīng)，由 5磷酸核酮糖生成 1， 5二磷酸核酮糖，需要 ATP 外 (共需要 6 分子 ATP)，其它反應(yīng)都不需要外加能量。 卡爾文環(huán)的能量轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)高， 18molATP 約計 ， 12molNADPH2 約計，即每合成 lmol 葡萄糖需輸入 。因此，有 90％的能量被貯存在合成產(chǎn)物葡萄糖分子中，只有 10％的輸入能量消耗于卡爾文環(huán)的運行，因此，能量轉(zhuǎn)化效率是很高的?？傊?，自養(yǎng)型 CO2 固定的特點是 CO2被固定在一有機(jī)物受體上，一些接受了 CO2的受體分子經(jīng)過一系列的反應(yīng)，將 CO2 組成碳水化合物，并重新生成該受體。從理論上來講，利用 1 分子草酰乙酸就可以不斷地推動 TCA 環(huán)的運行 (因為草酰乙酸可通 過 TCA 環(huán)再生 )。異養(yǎng)微生物依靠固定 CO2 生成四碳二羧酸，補充 TCA 環(huán)的中間產(chǎn)物。 5，蘋果酸酶：它催化丙酮酸還原羧化成蘋果酸，以 NAD(P)H2 為供氫體。 毫無疑問，以上六種酶，并不同時存在于一個有機(jī)體中，例如腸桿菌科中就以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為主，催化固定 CO2的反應(yīng)。以上固定 CO2 的途徑可歸納如圖 6— l0。 在核苷酸合成中也有固定 CO2 的反應(yīng)，如嘌呤核苷酸合成中， 5氨基咪唑核糖 5磷酸與 CO2反應(yīng)，生成 5氨基 4羧基咪唑核糖 5 磷酸。 異養(yǎng)型固定 CO2 的方式，在許多微生物中都有，甚至某些自養(yǎng)的光合細(xì)菌也有此種反應(yīng)方式。 第七節(jié) 微生物的光合作用 光合作用是自然界一個極其重要的生物學(xué)過程，除高等植物外，還有光合微生物，如藻類、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌 (包括紫色細(xì)菌、綠色細(xì)菌、嗜鹽菌等 )。把這類光合作用稱為放氧型光合作用。 光合作用的本質(zhì)是指生物 (包括植物、藻類和光合細(xì)菌 )將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能，并以穩(wěn)定形式貯藏的過程?，F(xiàn)分別介紹幾種光合細(xì)菌的能量轉(zhuǎn)化。 紫色細(xì)菌的光能點子傳遞途徑 從圖中可知，紫色細(xì)菌是以環(huán)式電子傳遞方式進(jìn)行的。 紫色細(xì)菌在生物合成中需要 NAD(P)H。在異養(yǎng)生長時，各種氧化還原電位較高的基質(zhì)對 NAD+的還原一般都是由光能推動的。 紫色細(xì)菌光能轉(zhuǎn)化的特點是：①紫色細(xì)菌能利用長波光， Bchl 吸收光的峰值為 870nm；②紫色細(xì)菌是環(huán)式電子傳遞方式進(jìn)行的； ③ 在異養(yǎng)生長時一般不能直接還原 NAD+為NADH。 （ 二 ）選擇原料的依據(jù) 1，原料選擇的原則 選擇淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精時，從工藝 的角度著眼，凡任何含有可發(fā)酵性糖或可變?yōu)榘l(fā)酵糖的原料，都可作為酒精生產(chǎn)的原料。 （ 2）要求原料內(nèi)碳水化合物含量較多，蛋白質(zhì)含量要適當(dāng)，適合與微生物的需要和吸收利用。由于酒精生產(chǎn)需要大量原料，要保證一定的庫存量。應(yīng)考慮到新鮮原料內(nèi)含水量 多，不耐久藏，最好選擇經(jīng)，干燥后，含水極少的干原料，易與保藏，不宜霉?fàn)€。 （ 6）原料價格低廉，可降低產(chǎn)品成本。另外，利用石油原料化學(xué)合成制造酒精，也是發(fā)展酒精的主要途徑。 例如 ICI 公司因指定用甲醇和氨生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)而另行設(shè)計新的發(fā)酵罐。 （ 2）從實驗室規(guī)模放大到實驗工廠規(guī)模，以至于放大到工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模，都要考慮培養(yǎng)基的組份的變化。 二、常用主要原料及其化學(xué)組成 （ 一 ）原料的種類 發(fā)酵 生產(chǎn)的原料，一般可分成下列幾類： 1， 薯類 ： 甘薯、馬鈴薯、木薯、山藥等。 3， 野生植物 橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金剛頭、香符子等。 （ 二 ） 常用原料的化學(xué)組成 原料所含的化學(xué)成分，不僅關(guān)系著生產(chǎn)率的高低，同時也影響生產(chǎn)的工藝過程。碳水化合物中的五碳糖多存在于原料的皮層，如麩皮、高粱糠，谷糠、花生殼等都含有很多，它不但影響淀粉數(shù)字偏高，發(fā)酵中也易生成有害的糠醛。 蛋白質(zhì) ： 原料含有的蛋白質(zhì)，在 發(fā)酵 生產(chǎn)過成中，經(jīng)蛋白酶水解后，可為 微生物 生長繁殖的重要營養(yǎng)成分，而微生物細(xì)胞中， 30~50%（干重）是蛋白質(zhì)。有些原料所含蛋白質(zhì)有時不能滿足微生物生長和繁殖的要求，則應(yīng)從外界加入氮源。 脂肪 ： 對發(fā)酵有影響，如高粱糠、米糠等含油脂多，則生酸較快，生酸幅度也較大。 灰分 ： 灰分中的磷、硫、鎂、鉀、鈣等是構(gòu)成菌體系胞的和輔霉的重要成分，還有調(diào)節(jié)滲透壓的作用，是微生物生長不可卻少的，在一般原料中，灰分的含量一足夠。在發(fā)酵過程中，我們的目的產(chǎn)品是菌體或代謝產(chǎn)物。 2，培養(yǎng)基設(shè)計的基本原則 培養(yǎng)基的組成必需 滿足 細(xì)胞的生長和代謝產(chǎn)物所需的元素，并能 提供 生物合成和細(xì)胞維持活力所需要的能量。在了解一定數(shù)量的生物體所能產(chǎn)生的產(chǎn)物數(shù)量后；就有可能計 算出形成產(chǎn)物時所需的底物數(shù)量。所有上述各項數(shù)量，是不易獲得其精確的數(shù)字。而其它元素含量則接近最低值(如 Zn， Cu 等 )。 （ 3）有些微 生物無力的合成特定營養(yǎng)物，如氨基酸、維生素或核苷酸。 （ 4）碳源具有生物合成的底物和能源的雙重作用，在需氧條件下，對碳源的需要量可以從菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù) (Yx/s)推算而得。如以葡萄糖為底物時，其 Y 值為 即表示每 1g葡萄糖能生成 細(xì)胞干物質(zhì)。 在發(fā)酵過程中，適當(dāng)?shù)匮a充碳源是必要的。但由于對生物合成的知識的限制而難以作出精密的分析。總的化學(xué)計算式為 方程式中的 a b c d e nz、 p2 和 q2 都是化學(xué)計算中的系數(shù)， PAA 代表苯乙酸。在青霉素分批發(fā)酵的一個簡單模型中，用于合 成細(xì)胞、維持生命活力和轉(zhuǎn)化成青霉素的葡萄糖，分別占總糖耗量的 2 61 和 11％。每克葡萄糖的最大青霉素轉(zhuǎn)化產(chǎn)量為 ，這個理論值數(shù)倍于實驗值。 （ 3） 氮源 （ 4） 無機(jī)鹽 （ 5） 維生素 （ 6） 緩沖劑 控制 pH 時對獲得最佳生產(chǎn)能力是十分重要的。許多種培養(yǎng)基多加入碳酸鈣作為緩沖劑，以達(dá)到 pH7． 0 左右。在許多培養(yǎng)基中，也用磷酸鹽作為重要的緩沖劑。在玉米漿中的蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等也具有緩沖容量。 （ 7）前體和代謝調(diào)節(jié)劑 （ 8）消沫劑 OHqCOpnPAAeSOHdOcNHbOHCa 222222422223261262 ??????? 卞青霉素 OHCOSNOHCOHCSOHONHOHC 222418182884222136126610 922 ??????? 第二節(jié) 原料處理 一、預(yù)處理的必要性 1，發(fā)酵工廠在進(jìn)行生產(chǎn)前，必須先將原料中混雜的小鐵釘、雜草、泥快和石頭等雜質(zhì)除去，保證后續(xù)工序生產(chǎn)的正常和順利進(jìn)行。 3，為保證生產(chǎn)環(huán)境的清潔，必須采用適當(dāng)?shù)妮斔头绞綄⒃蠌膫}庫運送至配料罐或反應(yīng)器。凡是厚度和寬度或空氣動力學(xué)性質(zhì) (懸浮速度 )與所用谷物不同的雜質(zhì)，都可用氣流 篩式分離機(jī)將其分離。 （ 二 ）原料的粉碎 1，原料 粉碎的目的 把原料進(jìn)行粉碎后成為粉末原料，其目的是要增加原料受熱面積，有利于淀粉顆粒的吸水膨漲、糊化，提高熱處理效率，縮短熱處理時間。 對于一些帶殼的原料，如高粱、大麥，在粉碎前，則要求先把皮殼破碎，除去皮殼后在形粉碎。 （ 2）皮殼在生產(chǎn)過程中，不發(fā)生變化，而大量皮殼匯集起來會占據(jù)一定的有效容積，無形中降低了設(shè)備的生產(chǎn)能力。 （ 4）皮殼會使蒸餾塔及冷卻器等設(shè)備發(fā)生阻塞。 一般對于帶皮殼的原料，處理過程要先行破碎， 脫去皮殼。 （ 1） 干粉碎 粗碎 ：原料過磅稱重后，進(jìn)入輸送帶，電磁除鐵后進(jìn)行粗碎。 粗砰常用的設(shè)備是軸向滾筒式粗碎機(jī)，也有用錘式粉碎機(jī)進(jìn)行粗碎的例子 細(xì)碎 ：經(jīng)過粗碎的原料進(jìn)入細(xì)碎機(jī)，細(xì)碎后的