【正文】 分離器。粗碎后的物料應(yīng)能通過6~10mm 的篩孔，然后再送去進(jìn)行細(xì)粉碎。皮殼漸多，需要停機(jī)清理，會給生產(chǎn)帶來損失。如果不把皮殼原料的外層去掉，有如下幾個缺點(diǎn)： （ 1）皮 殼本身毫無營養(yǎng)價值， 在發(fā)酵過程中 對微生物沒有好處，皮殼在醪液中會引起阻礙液體的流動。 2，磁力除鐵 包括 永久性磁力除鐵器和電磁除鐵器兩種方式。 2，為保證后續(xù)工序生產(chǎn)的正常和順利進(jìn)行，還需對原料進(jìn)行適當(dāng)加工。 碳源和氮源的平衡，也是控制 pH 的一種方式。在培養(yǎng)基中加入一種化合物作為緩沖劑或同時可作為營養(yǎng)源。在分批補(bǔ)料發(fā)酵時，則 26％的葡萄糖用于生長、 70％用于維持生命、 6％用于合成青霉素。 Cooney(1979)以青霉素生物合成的途徑為基礎(chǔ)，通過物質(zhì)和能量平衡，計算出青霉素生物合成的理論值。為要獲得 30gdm3 濃度的細(xì)胞，需要葡萄糖 30／ ＝ 60gdm3。一旦測出其中一種是生長因子，就要在培養(yǎng)基中加入適量的純凈的化合物或含有該物質(zhì)的混合物。 （ 2）組成微生物的元素包括 C、 H、 O、 N、 S、 P、 Mg 和 K（見下表），這些元素都要在方程式中予以平衡 細(xì)菌、酵母和真菌的元素組成 (按干重％計 ) 在培養(yǎng)基中有些元素的含量往往超過需要量，如 P和 K。 3，如何進(jìn)行培養(yǎng)基的設(shè)計 （ 1）作出細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的化學(xué)計算的平衡 碳源和能源 +氮源 +其他需要→細(xì)胞 +產(chǎn)物 +CO2+H2O++熱量 通過計算可以獲得生產(chǎn)一定數(shù)量的細(xì)胞時所需的營養(yǎng)物的最低數(shù)量。 三、工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計 1，為何要進(jìn)行培養(yǎng)基的設(shè)計？ 完善的培養(yǎng)基設(shè)計是實(shí)驗室的試驗、實(shí)驗工廠和生產(chǎn)規(guī)模的放大中的一個重 要步驟。蛋源一般包括有機(jī)蛋源和無機(jī)氮源兩種，根據(jù)不同情況，添加不同種類的氮源。纖維素雖屬于碳水化合物，但不被淀粉水解，只起填充作用，對于發(fā)酵沒有什么直接影響。 4， 農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物 米粞、米糠餅、麩皮、高粱糠、淀粉渣等。 （ 3）培養(yǎng)基的組成，除了考慮到菌體生長和產(chǎn)物的形成的需要外，還要考慮到培養(yǎng)基的 pH 變化、泡沫的形成、氧化還原電位和微生物的形態(tài)等，而且還有前體和代謝抑制劑的需要。 2， 在確定原料選擇原則時需注意的問題 （ 1）所選用的培養(yǎng)基與所使 用的發(fā)酵器的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 （ 5）對人民的身體無尋損害，影響發(fā)酵過程的雜質(zhì)含量因應(yīng)當(dāng)極少，或者幾乎不含。 （ 3）原料資源要豐富，容易收集。 第四章 培養(yǎng)基及其制備 第一節(jié) 原料 一 、 原料的 定義及選擇 （一）原料的定義 從工藝角度來看，凡是能被生物細(xì)胞利用并轉(zhuǎn)化成所需的代謝產(chǎn)物或菌體的物料，都可作為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的原料。當(dāng)其在氫中生長時，可以利用分子氫直接還原NAD(P)+為 NAD(P)H。 紫色細(xì)菌的光能轉(zhuǎn)化 紫色細(xì)菌的光能電子傳遞見下圖。在光合細(xì)菌中，光合作用還原 CO 2 的電子是來自還原型無機(jī)硫、氫或有機(jī)物，沒有氧的釋放，把這種類型的光合作用稱為非放氧型光合作用。這種固定 CO2方式的特點(diǎn)是 CO2 被固定在某種有機(jī)物 (主 要是有機(jī)酸 )中，結(jié)果是加長了碳鏈，使來自 CO2的碳原子也可用于某些物質(zhì)的生物合成。 此外，在脂肪酸合成 中也有固定 CO2 的反應(yīng)，如乙酰 CoA 在乙酰 CoA 羧化酶的催化下生成丙二酰 CoA，此反應(yīng)得要生物素和 ATP。 6，異檸檬酸脫氫酶：它催化 α酮戊二酸還原羧化成異檸檬酸，需要 NAD(P)H2。假如 TCA 環(huán)中的中間產(chǎn)物被用作生物合成的原材料，那么就必須加以補(bǔ)充，才能維持 TCA 的正常運(yùn)行。 另外還有還原的三羧酸環(huán)和還原的單羧酸環(huán)兩條途徑，感興趣的同學(xué)可參閱相關(guān)參考書。因此，每合成一分子葡萄糖，需要固定 6 分子 CO2，消耗 l8 分子 ATP和 12 分子 NADPH2，總反應(yīng)式為： 6CO2+18ATP+12NAD(P)H2 C6H12O6+18ADP+18Pi+12NAD（ P） ATP 和 NAD(P)H2被稱為同化力，在光合生物中是靠光能形成的，在無機(jī)自養(yǎng)細(xì)菌中則靠氧化無機(jī)物獲得。由于這些酶存在，保證卡爾文能沿合成方向運(yùn)行。 由上述一系列反應(yīng)所生成的 7磷酸景天庚酮糖在轉(zhuǎn)酮酶催化下與另一分子 3磷酸甘油醛反應(yīng)，生成 5磷酸木酮糖和 5磷酸核糖， 5磷酸核糖經(jīng)異構(gòu)化生成 5磷酸核酮糖， 5磷酸木酮糖經(jīng)表異構(gòu)化也生成 5磷酸核酮糖。另一部分則轉(zhuǎn)化 (異構(gòu) )為磷酸二羥丙酮，后者再與另一分子 3磷酸甘油醛縮合成 l， 6二磷酸果糖，并經(jīng)水解脫磷酸生成 6磷酸果糖。在糖酵解反應(yīng)中是以 NAD 為輔酶，所催化的反應(yīng)是降解與氧化；而在二磷酸核酮糖環(huán)中是以 NADPH2 為輔酶，所催化的反應(yīng)是生物合成與還原。 3P甘油酸是 CO2固定過程中的第一個穩(wěn)定中間產(chǎn)物。 二磷酸核酮糖環(huán) ：這個途徑最初是由卡爾文 (Calvin)等研究綠藻的光合作用時查明的，所以又稱 為卡爾文環(huán)。 （ 4）光合異養(yǎng)微生物水氣轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)生氫氣 一些光合異養(yǎng)微生物在暗條件下能夠利用 CO 做為 單一碳源，產(chǎn)生 ATP 的同時釋放出H CO2 CO(g) + H2O(l) → CO2(g) + H2(g) ① Rubrivivax gelatinosus CBS 不僅可以 在暗條件下進(jìn)行 CO水 氣轉(zhuǎn)換反應(yīng)，而且能利用光能固定 CO2 將 CO 同化為細(xì)胞質(zhì)；即使在有其 他有機(jī)底物的情況下，其也能夠很好利用CO ② Rubrivivax gelatinosus CBS 能夠 100%轉(zhuǎn) 換氣態(tài)的 CO 成 H2。 PSII 抑制劑，如： DCMU、CCCP、 FCCP。由于果糖分解脫下的氫不能交給 NAD(P)+(因消耗于環(huán)境中氫的還原 )故在這種情況下不能利用果糖等有機(jī)物。共原因有兩方面： (1)果糖的利用是通過 ED 途徑進(jìn)行的。在氧限量時， CoQ 明顯減少，當(dāng)氧過量時， VK2 含量極微。另外，它可直接運(yùn)送電子進(jìn)入呼吸鏈，兩種氫化酶的作用及電子傳送途徑見下圖。 可溶性氫化酶催化氫的氧化，能直接還原 NAD+，還能還原 Cytb、 Cytc 等，它不與氧、NAD+和甲烯藍(lán)起反應(yīng)，它受 ADP 相 ATP 相對濃 度的控制，當(dāng) ADP 缺少， ATP 過量時，酶的活性受抑制。顆粒狀氫化酶結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上，它直接與呼吸鏈偶聯(lián)，不經(jīng)過依賴于 NAD+的脫氫酶作中間體，催化氫的氧化，并把電子直接傳給呼吸鏈產(chǎn)生 ATP。 在有分子氫和氧的條件下，氫細(xì)菌在生長過程中實(shí)際上包括兩個過程：①分子氫氧化成水，放出能量；②分子氫還原 CO2 成為細(xì)胞物質(zhì)，總的結(jié)果是以 6： 2： l 的比例消耗 H2，O2 和 CO2，其反應(yīng)如下： 四分子氫 氧化成水所放出的能量可產(chǎn)生一分子 ATP，用于還原 CO2 構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和維持細(xì)菌的生長。實(shí)際上，有幾種微生物可以利用環(huán)己醇生長．如小球諾卡氏菌 (Nocardia globerula)對環(huán)己醇的降解過程如下圖所示。目前已知一種微生物能以環(huán)己烷作為唯一的碳源和能源而生長。如下圖所示。這是 1971 年 Reiner 等才弄清其確切的反應(yīng)順序。 苯的微生物氧化 苯轉(zhuǎn)化成鄰苯二酚的酶系是由三個組分構(gòu)成的：①分子量為 60000 含有 FAD 的蛋白質(zhì)；②分子量為 21000 含有非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，②分子量為 186000 含有非血紅素鐵的紅色蛋白質(zhì)，這些組分的功能如下圖所示。若在菌體生長階段接近終了或終了后立即加入蛋白質(zhì)、核酸抑制劑，這些酶便不能合成，次級代謝過程將不能進(jìn)行。又如麥角菌 (C． purpurea)的營養(yǎng)缺陷型菌株，在含葡萄糖及酵母膏的天然培養(yǎng)基中，先長菌體，繁殖期合成生物堿，而在合成培養(yǎng)基中，菌體生長緩慢，同時合成生物堿。因此，此類微生物的生長和次級代謝過程可以區(qū)分為兩個階段，即菌體生長階段和代謝產(chǎn)物合成階段。賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)控制著青霉素的合成。纈氨酸、半胱氨酸是合成青霉素，頭孢霉素的前體。 諾卡霉素 A(nocardicinA)分子裝配如下圖所示。 RH+O2+NADPH2→ ROH+H2O 十 NADP 次級代謝中的氯化反應(yīng)，可以看作是特征性的反應(yīng)，在氯過氧化物酶催化下進(jìn)行。 第二步，結(jié)構(gòu)修飾。 第一步，前體聚合。例如由粘質(zhì)賽氏桿菌 (Serratia marcescens)產(chǎn)生靈菌紅素，在細(xì)胞內(nèi)積累，使菌落呈紅色。放線菌，真 菌也產(chǎn)生毒素。 生物堿：大部分生物堿是由植物產(chǎn)生的。 抗生素：這是微生物所產(chǎn)生的，具有特異抗菌作用的一類次級產(chǎn)物。放線菌產(chǎn)生的很多次生物質(zhì)屬于此類型。 （ B）由二個氨基酸形成的曲霉酸、支霉粘毒 (gliotoxin)。 另一類是由乙酸得到的有機(jī)酸與 TCA 環(huán)上的中間產(chǎn)物縮合生成次級產(chǎn)物，例如，脂肪酸 α亞甲基與草酰乙酸或 α— 酮戊二酸羧基或羰基縮合。例如四環(huán)素抗生素類 。擔(dān)子菌中也能見到。 （ C）由磷酸戊糖合成的次級代謝物質(zhì)較多?，F(xiàn)簡介如下： 1，根據(jù)產(chǎn)物合成途徑區(qū)分類型 根據(jù)產(chǎn)物合成途徑可以分為五種類型。這一過程的產(chǎn)物即為次級代謝產(chǎn)物。他把值物產(chǎn)生的與植物生長發(fā)育無關(guān)的某些特有的物質(zhì)稱為次級代謝物質(zhì)，合成和利用它們的途徑即為次級代謝。本節(jié)將概述次級代謝的概念及其類型。此外，微生物還能進(jìn)行次級代謝。 一、 次級代謝的概念及類型 （一）次級代謝的概念 次級代謝的概念是 1958 年由植物學(xué)家 Rohland 首先提出來的。它具有許多特點(diǎn)，根據(jù)這些特點(diǎn)可以認(rèn)為次級代謝是指：微生物在一定的生長時期 (一般是穩(wěn)定生長期 )，以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對微生物的生命活動 沒有明確功能的物質(zhì)的過程。有的研究者按照次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生菌不同來區(qū)分；有的根據(jù)次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或作用來區(qū)分；有的則根據(jù)次級代謝產(chǎn)物合成途徑來區(qū)分。 曲酸 （ B）由預(yù)苯酸合成芳香族次級代謝產(chǎn)物，例如放線菌產(chǎn)生的氯霉素、新霉素等。這種次級物質(zhì)多在高等植物中存在。由此進(jìn)一步生成不同的次級代謝產(chǎn)物。 （ 4）與 TCA 環(huán)有關(guān)的類型 與 TCA 環(huán)相連的次級代謝產(chǎn)物也可以分為兩類： 一類是從 TCA 環(huán)得 到的中間產(chǎn)物進(jìn)一步合成次級產(chǎn)物，例如由 a— 酮戊二酸還原生成戊烯酸，由烏頭酸脫羧生成衣康酸。 （ 5）與氨基酸代謝有關(guān)的類型 與氨基酸代謝有關(guān)的次級代謝，可以分為三類： （ A）由一個氨基酸形成的次級代謝產(chǎn)物，如放線菌產(chǎn)生的環(huán)絲氨酸、氮絲氨酸；擔(dān)子菌由色氨酸合 成口磨氨酸、鵝膏 氨酸、二甲基 4羥色胺磷酸以及靛藍(lán)等。 （ C）由三個以上氨基酸縮合而成的次級產(chǎn)物，氨基酸之間多以肽鍵結(jié)合成直鏈狀，例如鐮刀菌 (Fusarium)產(chǎn)生的恩鐮孢菌素 (enniatine)。 2，根據(jù)產(chǎn)物的作用區(qū)分類型 根據(jù)次級代謝產(chǎn)物的作用可以分為抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素等類型。例如赤霉菌 (Gibberella fujikuroi)產(chǎn)生的赤霉素。如破傷風(fēng)梭菌 (Clostridium tetani)產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素，白喉桿菌 (Corynebacterium diphtheriae)產(chǎn)生的白喉毒素，肉毒梭菌(Cl． botulinum)產(chǎn)生的肉毒素及蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis)產(chǎn)生的伴胞晶體等。 色素：不少微生物在代謝過程中產(chǎn)生各種有色的產(chǎn)物。 二、次級代謝產(chǎn)物的生物合成 次級代謝產(chǎn)物的合成過程可以概括為如下模式： 次級代謝產(chǎn)物的合成是以初級代謝產(chǎn)物為前體，進(jìn)入次級代謝產(chǎn)物合成途徑后，大約經(jīng)過三個步驟，合成次級代謝產(chǎn)物。多肽類抗生素由合成酶催化，由氨基酸生成多肽鏈。次級代謝中的加氧酶多是單加氧酶，它把氧分子中的一個氧原子添加到底物上，另一個氧原子還原成水，并常伴有 NADPH 的氧化。如新生霉素的幾個組分， 4甲氧基 5’， 5’ 二甲基 L來蘇糖 (noviose)、香豆素和對經(jīng)基苯甲酸等形成后，再經(jīng)裝配成新生霉素，圖示如下。例如糖降解產(chǎn)生的乙酰 CoA 是合成四環(huán)素、紅霉案及 β胡蘿卜素的前體。例如三羧酸循環(huán)可以調(diào)節(jié)四環(huán)素的合成。而次級代謝一般只是在菌體對數(shù)生長后期或穩(wěn)定生長期進(jìn)行。例如氯霉素在天然培養(yǎng)基中是菌體繁殖期合成，而在合成培養(yǎng)基中，它的合成與生長平行。例如，青霉素合成中的酰基轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素合成中的脒基轉(zhuǎn)移酶等次級代謝中的關(guān)鍵酶都在合成階段被合成。 苯轉(zhuǎn)化成鄰苯二酚：苯的氧化首先是生成二羥基已二烯，再轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，其過程見下圖。從下圖可見，苯甲酸是如何轉(zhuǎn)化成鄰苯二酚的。進(jìn)一步分解則得琥珀酸、乙酰輔酶A 和丙酮酸、乙醛，再由 TCA環(huán)完全氧化或進(jìn)入其他生物合成途徑。 脂環(huán)烴的分 解：在全部烴類中，脂環(huán)烴對微生物作用的抗性最強(qiáng)。如果有環(huán)已烷同時存在，則環(huán)己烷披共氧化為環(huán)已醇，然后環(huán)已醉被混合培養(yǎng)物中的另一種微生物所降解。它們能利用分子氫，氧化產(chǎn)生的能量同化 CO2，也能利用其它有機(jī)物進(jìn)行生長。 （ 1）顆粒狀氫化酶 (particulate hydrogenase) 如真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 (A． eutrophus)的顆粒狀氫化酶是由兩個亞基組成的，一個亞基分子量為37000，另一個亞基分子量為 37000，二者之比為 1： 1。 （ 2）可溶性氫化酶 (so1uble hydrogenase) 真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 (A． eutrophus)的可