【正文】 得出的適于耕種（如谷物、蔬菜和馬鈴薯）的土壤微生物多樣性可以與有機土壤相比較，在過去的十年中單獨使用牧場地。對 這些克隆的 rRNA 基因進行測序 ， 然后與數(shù)據(jù)庫中的進行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系?？寺〉臄U增子可以與指紋圖譜方法的進行比較（如 ARDRA）。從環(huán)境中獲得的 DNA通過克隆載體由 PCR擴增 rRNA基因得到克隆文庫。一系列不同系統(tǒng)發(fā)育探針雜交后在顯微鏡下計數(shù)，可以確定體統(tǒng)發(fā)育群體的數(shù)量和分類學上的個體的相對分布。為了克服這個缺陷，人們采用了一種 酪胺信號放大技術(shù) 用于 FISH，該技術(shù)可以分析緩慢生長的微生物。 標準的熒光原位雜交方法存在一些缺陷，在敏感度方面它不能檢測出低核糖體含量的細胞。點墨雜交和熒光原位雜交已經(jīng)被聯(lián)合用于區(qū)分 不同程度的金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)。在probeBase 網(wǎng) 站 可 以 找 到 合 適 的 熒 光 原 位 雜 交 的 探 針（ 雜交方法可以幫助分辨群落中特殊部分（如有機群體）的物種組成。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料 標記然后用來做環(huán)境樣品的單細胞的原位檢測 （整個細胞雜交）。 通過選擇 rRNA 的保守的、可變的和超變區(qū)序列，探針可以標記從域到亞種的不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育基團。 雜交技術(shù) 該方法是 設(shè)計出與 16S rRNA 或者 23S rRNA 序列相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針 ，然后 用來和 rRNA 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對。 另外一個鑒定群落成員的方法就是應(yīng)用特別的富 集培養(yǎng)基以加快 感興趣的微生物的生長。評估真菌多樣性一直是一個問題，因為使用的引物可以同時擴增其他真核生物的 DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。 根 據(jù) Gomes 等報道，區(qū)分不同的細菌系統(tǒng)發(fā)育群體可以使用以下引物： F984GC,F27,R1378 和 R1494（細菌）和 F243HGC（放線菌）， F203α（ α變形菌） 和 F948β（ β變形菌）。 當大量的 PCR 擴增物相似性太高以致于不容易分辨時，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時就有局限。然后片段進行毛細管電泳，根據(jù)大小自動分離，它們的大小可以與 DNA 數(shù)據(jù)庫中的進行比較。這種方法成功地被用來分類菌株和指紋鑒定簡單的群落和混合的種群。 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離。然后，酶切樣品數(shù)據(jù)與使用數(shù)據(jù)庫序列獲得的已知細菌的 rDNA 限制性分析進行比較。在 PCR 過程中通過加入熒光標記的 dUTP 獲得的熒光 PCR 擴增物可以直接進行自動的 ARDRA。除了基于 持家基因（例如rDNA）的分析， TRFLP 也被用來分析像汞抗性基因這樣的功能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。通過使用計算機程序在數(shù)據(jù)庫中在 16SrDNA 序列上確定恰當?shù)南拗菩?酶切位點， 不同的限制性酶切出的 rRNA 的TRF 片段大小差異可以預(yù)測出來，實驗獲得的 PCR 擴增物的 TRF 峰或者從群落 DNA獲得的 16SrDNA 克隆文庫可以與預(yù)測的 TRF 峰或者系統(tǒng)發(fā)育分類進行比較。熒光標記的片段可以在自動分析儀里通過熒光檢測器進行檢測 ，因此，這種技術(shù)只檢測末端標記的限制性片段。兩個引物通常都是使用熒光亞磷酰胺染料標記 5’末端。 TRFLP方法是基于對末端熒光標記的 PCR擴增物進行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。 SSCP 方法原則上比 DGGE/TGGE 方法要容易操作，因為它不需要帶 GC 夾子的引物和梯度凝膠所需要的特殊儀器。這種方法的可重復性和辨別能力取決于片段的大小和片段內(nèi)序列變化的 位置，通常片段小于400bp 效果最理想。這種 13 方法是基于單鏈 DNA 的不同分子內(nèi)折疊，其本身取決于 DNA 序列的變化。 完整的鏈通過在非變性條件下（低溫）優(yōu)化的 SSCP 聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。 SSCP，像 DGGE/TGGE 一樣，可以檢測從 rDNA 可變區(qū)獲得的不同 PCR 擴增物的序列變化。 DGGE/TGGE 在快速篩選大量樣本以區(qū)分土壤微生物群落時很有效。把 DGGE 條帶的序列與數(shù)據(jù)庫中的序列比較，可以獲得原來微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育聯(lián)系。群落的分類學組成信息可以通過凝膠印跡和與遺傳分子探針雜交、靶標細菌和古生菌中的主要的系統(tǒng)發(fā)育亞種。 這種技術(shù)的一個不足就是不同生物的 16SrDNA 能夠在變性凝膠上形成一條特定的條帶。 使用可以與可變區(qū)附近的保守區(qū)退火的引物，對 微生物群落 DNA 中的 rDNA的可變區(qū)（ 230500bp）進行 PCR 擴增。隨著 DNA 分子在變性凝膠中遷移，它們開始在特定的熔解區(qū)熔解，因此它們開始變成部 分單鏈。 DGGE 依靠變性物質(zhì)（尿素和甲酰胺）的濃度梯度，而 TGGE 卻基于溫度梯度。在 DGGE/TGGE 方法中，相同長度但是不同核苷酸序列的 DNA 片段被分離。但是，基于 PCR 的技術(shù)也有很多的缺陷，例如 ：由于優(yōu)先擴增某些細菌的目標 DNA 序列而導致的 PCR 擴增差異；形成嵌合分子；由于許多的操縱子的存在導致從一株細菌獲得許多不同的 PCR 擴增產(chǎn)物；復雜群落的擴增產(chǎn)物數(shù)量太多以至于很難分離和分析。像末 端限制性片段長度多態(tài)性 ， 這樣的新方法使用熒光標記 PCR 擴增物，然后 通過 在自動測序系統(tǒng)中使用 激光檢測熒光 DNA 片段來分離 PCR 產(chǎn)物。 Tiedje 等質(zhì)疑微生物是世界性的這個假說，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個 取樣點微生物的基因型都是特異性的。這種非培養(yǎng)的 rRNA 方法揭示了新的血統(tǒng)，在系統(tǒng)發(fā)生學角度不同于培養(yǎng)方法和特征性的土壤探針。 核糖體 RNA 基因（ rDNA） 以及 它們的 轉(zhuǎn)錄片段和 rRNA 分子是分類鑒定和衡量微生物遺傳多樣性最常用的標記物。每一個 BAC 克隆代表一個元基因組片段 ，它可能包含具有它們自己啟動子的基因和操縱子，從而能夠使它們在大腸桿菌宿主中表達。這可以通過與特殊探針進行雜交、遺傳指紋識別和測序來實現(xiàn)。從F質(zhì)粒獲得的 BAC 載體可以在大腸桿菌宿主內(nèi)穩(wěn)定地保存大的插入序列。然而，為了更好的估計 C0t1/2值 需要重復多次以達到 50%的重聯(lián)率。 另外， 為了更加精確地估計高純度的 DNA，必須使用統(tǒng)一的片段長度。 C0代表摩爾核苷酸每升， t 代表時間 /秒 為了估計原核生物的多樣性， DNA必須高度純化并且與真核生物的 DNA區(qū)分開來。 Dr248。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構(gòu)，檢測和鑒定活細胞，群落成員的直接系統(tǒng)發(fā)育信息 注： G+C 鳥嘌呤 +胞嘧啶， PCR 聚合鏈反應(yīng)， DGGE變性梯度凝膠電泳， TGGE溫度梯度凝膠電泳， SSCP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性， TRFLP末端限制性片段電泳， ARDRA擴增核糖體 DNA限制性分析， RISA基因間隔區(qū)分析， FISH熒光原 位雜交 11 表 2 在 6 倍檸檬酸鹽、 30%二甲亞砜中計算得出的微生物群落遺傳多樣性重新組合動力學 DNA 來源 C0t1/2 土壤群落 DNA 堿基大小 （ bp） DNA 土壤 / 大腸桿菌 DNA 大腸桿菌 106 1 牧地土壤（ StendO） 6300 1010 8000 耕種土壤（ StendS） 270 109 340 污泥修復的土壤；未污染的 7800 1010 9800 污泥修復的土壤；低金屬的 3700 1010 4600 污泥修復的土壤；高金屬 的 1200 109 1500 注： 土壤群落 DNA 大小用堿基對（ bp），相等的大腸桿菌基因組（ ： 106bp）（ (Br248。高分辨率 比較 分析群落功能性的潛能 RNA 點墨雜交 群落成員的代謝活力的系統(tǒng)發(fā)育鑒定。高分辨率 比較分析微生物種群動力學，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCR of rDNA克隆和測序 系統(tǒng)發(fā)育多樣性，群落組成鑒定。中等分辨率 比較分析微生物種群 的分布，監(jiān)測群落組成的變化 PCRARDRA 簡單群落，種群或者系統(tǒng)發(fā)育屬的遺傳指紋圖譜。低分辨率 比較分析群落組成的全部變化 PCRDGGE/TGGE 個別條帶測序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢群落成員的聯(lián)系。s 等 ， 1998） 10 表 1 土壤微生物多樣性研究的分子學方法 方法 信息類型和 分辨率 在土壤微生物分析中應(yīng)用 DNA 重新組合速率 總遺傳多樣性，理論性的物種數(shù)量，群落基因組 大小。 圖 8 大腸桿菌的 DNA 的重新組合（ C0t，其中 C0代表摩爾核苷酸每升， t代表時間 /秒），或未處理土壤中的細菌部分（ K），厭氧條件下的土壤（ N2）和 CH4作為主要碳源的土壤（ CH）（ 216。 當應(yīng)用于微生物群落 DNA 時， C0t1/2值 被用作遺傳多樣性的一個參數(shù)，它包含了 群落總的遺傳信息（豐富度成分）和不同遺傳型之間的差異信息（均勻度成分）。氮氣和甲烷影響的土壤 DNA 的 C0t1/2值 分別減少到了 2500 摩爾每秒每升和 300 摩爾每秒每升。 重連結(jié)果顯示干擾減少了微生物多樣性（圖 8，表 2）。由于復雜性已知 [ 106堿基對 （ bp） ]， B 基因組 DNA 的重聯(lián)速率作為標準曲線（表 1）。土壤微生境或者是埋于甲烷氣體環(huán)境下以此為 C源（ CH），或者是在厭氧條件 下 （ N2） 。 C0t1/2（ 50%DNA 重聯(lián)時 ）用來估計 DNA 的復雜性 。隨著DNA 復雜性的提高或者溶液中不同 DNA 型 的數(shù)量，變性比率 會下降。 從微生物群落分離出來的 DNA 復雜性是對總遺傳多樣性的一個估計。雙苯酰亞胺 氯化銫梯度超離心分離得到的群落 DNA 片段可以結(jié)合分子生物方法來進一步分析不同的 G+C%含量，例如 PCR 和 DGGE。從另外一方面來說，如果群落之間有不同的堿基差異，這可以有力的說明它們之間物種組成 是不同的。因此，根據(jù)堿基組成通過雙苯酰亞胺密度梯度離心可以將群落 DNA 分離開來。 DNA堿基組成曲線圖也可以通過笨亞甲胺 DNA 復合物在氯化銫梯度下等密度梯度離心來獲得。解鏈曲線轉(zhuǎn)化成 %G+C 的峰，以此來提供微生物群落的峰，從而能夠指示整個的遺傳多樣性。這個由熱變性即可測定，因為單鏈 DNA 比雙鏈 DNA 在 260nm的吸光能力大概高 35%。 高分辨率的指紋識別方法也已經(jīng)被用于監(jiān)測微生物群落的特殊種群和評估細菌群體和克隆基因的多樣性。 高等分辨率的方法包括非編碼 DNA 區(qū)域的指紋識別（例如 repPCR擴增重復性序列）和 編碼區(qū)及 非編碼區(qū)的測序。他們認為，從整個群落和（或）分離的或克隆得到的峰通過與預(yù)先存儲的 TRF 片段的數(shù)據(jù)庫進行比較，可以直接鑒定峰中的某些片段 在分類學中的位置。 rRNA 或者 rDNA的限制性分析 [擴增核糖體 DNA 限制性分析（ ARDRA）；末端限制性片段電泳（ TRFLP） ]可以在高水平的分類學等級進行區(qū)分，甚至可以鑒別到種。這些指紋識別方法相同的地方是都使用了 PCR 來特異擴增目標核苷酸。 這些方法可以用 來確定目標微生物的數(shù)量和測定微生物群落的全部的分類學組成。 通過高和低的分辨率 ， 細菌人工染色體文庫可以用來在系統(tǒng)發(fā)生和功能水平上研究土壤微生物多樣性。 PCR 聚合鏈反應(yīng)， DGGE 變性梯 度凝膠電泳， SSCP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性， TRFLP 末端限制性片段電泳， RISA 基因間隔區(qū)分析， %G+C 摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶 從微生物群落獲得的總基因組 DNA（元基因組）可以提供全部群落結(jié)構(gòu)和總遺傳多樣性的補充信息。為了說明分子方法的有效性和簡便性，文章中給出了它們在研究本地有關(guān)受污染和干擾的土壤微生物群落的 一些 具體應(yīng)用的例子 （圖 7） 。 這些微生物核苷酸信息可以用來觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。 但是 ， 取自環(huán)境中的樣品無論是可培養(yǎng)的還是不可培養(yǎng)的微生物都可以用基于提取、純化和核苷酸特性的分子技術(shù)來鑒定。這些方法有很多的不足。數(shù)據(jù)來自 Yan 等（ 2020，圓圈 ）和 Sharma 等（ 1997，黑點 ） 7 從這些數(shù)據(jù)可以看出，在某一特定的臨界值以前（例如 %有機 C），功能多樣性隨土壤微生物生物量單調(diào)遞增。在那種情況下，斷棍模型給出了最好的解釋（圖6）。 CLPP 方法得出的數(shù)據(jù)經(jīng)常被用于表示土壤