【正文】 活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (activation induced cell death, AICD)作用參與外周克隆剔除和活化T 細(xì)胞的清除的。但在這些小鼠中，外周克隆剔除和活化 T 細(xì)胞的清除發(fā)生了障礙， 中國(guó)最大的管理資料下載中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 20 頁(yè) 共 68 頁(yè) T細(xì)胞可以在外來(lái)抗原的刺激下發(fā)生正常的活化和增殖，但卻不能在完成使命之后被有效清除掉，這些小鼠常伴有自身免疫性疾病的發(fā)生。另外，當(dāng)活化 T細(xì)胞與外來(lái)抗原反應(yīng)后，機(jī)體也存在著清除機(jī) 制殺傷這些細(xì)胞，以免大量活化的 T 細(xì)胞在外周堆積，影響免疫系統(tǒng)的功能的穩(wěn)定和平衡。前 T 細(xì)胞在胸腺中要經(jīng)過(guò)陽(yáng)性選擇和陰性選擇， 95%的前 T 細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，只有 5%可以成熟進(jìn)入外周血。 CD4+的 TH1和 TH2細(xì)胞也可以通 過(guò) Fas/FasL機(jī)制殺傷細(xì)胞，一般來(lái)說(shuō)， TH1 細(xì)胞的殺傷活性要高于TH2 細(xì)胞。所以 CTL 細(xì)胞在活化后，可以通過(guò)兩條互不相關(guān) 的途徑殺傷靶細(xì)胞：一方面，分泌穿孔素和顆粒酶，以 Ca2+依賴的方式作用于靶細(xì)胞膜，殺傷靶細(xì)胞；另一方面，在 CTL 細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后，細(xì)胞表面表達(dá)的高水平 FasL 與靶細(xì)胞表面的 Fas 相互識(shí)別，通過(guò) Fas 觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有 Ca2+存在的情況下，活化的 CTL 細(xì)胞系 PC60d10S 仍然可以殺傷靶細(xì)胞。而顆粒酶是一類絲氨酸酯酶，進(jìn)入胞漿后可以直接活化胞漿中的蛋白酶，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。佛波酯 (PMA)和離子霉素可以促進(jìn) FasL 表達(dá)，環(huán)孢素 A 可以抑制 FasL 的表達(dá)。 FasL 基因位于 1 號(hào)染色體，與 OX40L 基因相鄰，由 5 個(gè)外顯子組成。 FasL 在胞膜外區(qū)有 4 個(gè) N糖基化位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)糖基化的 FasL的分子量為 3643kD。 IFNg 和 TNFa 可以增強(qiáng) Fas 的在多種細(xì)胞中的表達(dá)，從而增強(qiáng) Fas 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 Fas 表達(dá)比較廣泛，小鼠的胸腺、心臟、肝、肺、腎和卵巢等都有表達(dá)，在胸腺中除 CD4CD8的雙陰性細(xì)胞外，其它所有細(xì)胞都表達(dá)Fas。 人 Fas 基因定位于 10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂，小鼠 Fas 基因位于 19 號(hào)染色體，各包含 9 個(gè)外顯子。 在 Fas 的 C 端有 15aa 對(duì)死亡結(jié)構(gòu)域的作用可能有抑制功能，將這 15aa 突變掉之后， Fas 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用得以增強(qiáng)。 對(duì) Fas 胞漿區(qū)氨基酸序列的比較發(fā)現(xiàn)，它與 TNFRI 有一段 68aa 的同源序列，這段序列對(duì) Fas 和 TNFRI 所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著決定性的作用，用基因突變的方法將同源區(qū)進(jìn)行改造后，它們就喪失了致凋亡的能力，所以這一同源區(qū)被命名為死亡結(jié)構(gòu)域。胞漿區(qū)長(zhǎng) 145aa，其中有 24 個(gè)堿性氨基酸和 19 個(gè)酸性氨基酸。胞膜外區(qū) (157aa)有 3 個(gè) CRD，其中有 2 個(gè) N糖基化位點(diǎn)?；蚩寺∽C明， Fas 和 Apo1 是同一種蛋白。 1. Fas 與 FasL 的結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)特征 1989 年 Yonehara 等發(fā)現(xiàn)了一株單克隆抗體，這株抗體可以識(shí)別一種表達(dá)于髓樣細(xì)胞、 T 淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表面的未知分子，誘導(dǎo)多種人細(xì)胞系發(fā)生凋亡，這種新的膜分子被稱為 Fas。在人類獲得性免疫缺陷綜合征 (AIDS)時(shí)，在 HIV 感染的 CD4+T 細(xì)胞表面有高表達(dá)的 Fas， 這些 T細(xì)胞易于被 CTL 細(xì)胞所殺傷，這是 AIDS 導(dǎo)致 T 細(xì)胞功能低下的原因之一。研究證明，他們的 Fas 基因不同程度地發(fā)生了基因缺失，不能表達(dá)全長(zhǎng)的 Fas 蛋白。 (3)人類類似 lpr 和 gld 疾?。涸谌祟悾灿蓄愃朴?lpr 和 gld 小鼠的癥狀的報(bào)道。 (2)小鼠 gld：研究也證明， gld 小鼠的病變發(fā)生在FasL 基因，其 C 端編碼區(qū)有一個(gè)點(diǎn)突變，使胞膜外區(qū)與 Fas 結(jié)合部位的一個(gè)苯丙氨酸變成了亮氨酸，使之不能與 Fas 結(jié)合，從而失去了功能。在 lpr小鼠肝臟和胸腺只有非常少的 Fas mRNA，而且往往成熟 mRNA 中只有外顯子 1 和 2，不能編碼正常 Fas蛋白。對(duì) lpr 小鼠 Fas 基因的分析發(fā)現(xiàn)，一個(gè)長(zhǎng)約 的反轉(zhuǎn)座子 ETn 插入到 Fas 基因的第二個(gè)內(nèi)含子。 (1)小鼠 lpr：雖然 lpr 與 gld 不是等位基因的突變，但它們的表現(xiàn)卻極為相似。動(dòng)物在出生5 個(gè)月后出現(xiàn)免疫復(fù)合物型腎炎和關(guān)節(jié)炎。 中國(guó)最大的管理資料下載中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 16 頁(yè) 共 68 頁(yè) 4. Fas/FasL 異常所引起的疾病 小鼠天然突變性疾病 lpr(lymphoproliferation)和gld(generalized lymphorpoliferative disease)的突變分別發(fā)生于小鼠 19 號(hào)和 1 號(hào)常染色體。遷移到外周淋巴器官的 B 細(xì)胞，在被抗原活化后，細(xì)胞表面的 Fas表達(dá)水平也明顯升高，這有可能使活化 B 細(xì)胞表面的 Fas通過(guò)與 CTL 細(xì)胞表面的 FasL 的結(jié)合而被殺傷。這種機(jī)制可能隨著動(dòng)物的成年而消失或減弱，所以在成年動(dòng)物表現(xiàn)出比較明顯的活化淋巴細(xì)胞的堆積。但在幼年的 lpr和 gld 小鼠，活化 T 細(xì)胞的堆積并不明顯。另外， FasL 還可以從細(xì)胞膜表面脫落下來(lái)，形成可溶性配體分子，這些可溶性分子可以自分泌和旁分泌的方式，作用于自身細(xì)胞和鄰近活化 T 細(xì)胞，分別進(jìn)行自分泌殺傷和旁分泌殺傷。在 TCR 的誘導(dǎo)下， T 細(xì)胞一方面被活化，另一方面被誘導(dǎo)表達(dá) Fas 和 FasL。這說(shuō)明 Fas 既參與了外周淋巴器官中自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞克隆的剔除，又參與了對(duì)外來(lái)抗原反應(yīng)過(guò)的活化 T 細(xì)胞的清除。 在兩種 Fas/FasL 突變導(dǎo)致的疾病 lpr 和 gld 小鼠中胸腺的陽(yáng)性選擇和陰性選擇是正常的，說(shuō)明 Fas 可能不參與胸腺中的陽(yáng)性和陰性選擇。進(jìn)入外周血的 T 細(xì)胞還要經(jīng)過(guò)外周克隆剔除 (peripheral clonal deletion)的選擇過(guò)程，進(jìn)一步剔除能與外周組織表達(dá)的自身抗原發(fā)生反應(yīng)的 T 細(xì)胞。 3. Fas 介導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡 在淋巴細(xì)胞的生活周期中，不同階段的 T 細(xì)胞和B 細(xì)胞都會(huì)發(fā)生正常的死亡。 CTL 細(xì)胞的這兩條殺傷機(jī)制是相互獨(dú)立的，因?yàn)榇┛姿鼗蚯贸男∈?，以及不表達(dá)穿孔素的 CTL細(xì)胞系 ，都具有正常的 Fas/FasL 依賴的殺傷功能；而在 Fas/FasL 系統(tǒng)突變性疾病的小鼠中，穿孔素 /顆粒酶殺傷機(jī)制仍是健全的。進(jìn)一步的研究證明，這個(gè)細(xì)胞系是通過(guò) Fas/FasL 實(shí)現(xiàn)其 Ca2+非依賴性殺傷作用的。穿孔素和顆粒酶的作用是 Ca2+依賴的。 2. Fas 參與 CTL 細(xì)胞的殺傷機(jī)制 在 Fas/FasL 發(fā)現(xiàn)以前， 一般認(rèn)為 CTL 細(xì)胞的殺傷作用是通過(guò)穿孔素 (perforin)和顆粒酶 (granzyme)實(shí)現(xiàn)的，穿孔素在 Ca2+存在的條件下可以插入靶細(xì)胞膜，并多聚化形成管狀結(jié)構(gòu)，破壞靶細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。 FasL 只表達(dá)于活化 T 淋巴細(xì)胞， 中國(guó)最大的管理資料下載中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 14 頁(yè) 共 68 頁(yè) 其它細(xì)胞如 B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及胸腺細(xì)胞都不表達(dá) FasL，但在小鼠的睪丸組織中，卻可見到高表達(dá)的 FasL。 FasL的胞漿區(qū)富含脯氨酸。 Fas 的配體 FasL 于 1993 年由 Suda 等從 CTL 雜交瘤衍生的細(xì)胞系 PC60d10S 細(xì)胞系中克隆成功， FasL 長(zhǎng) 278aa，為 II 型跨膜糖蛋白，由胞膜外區(qū) (179aa)、跨膜區(qū) (22aa)和胞漿區(qū) (77aa)組成， N 端 150個(gè)氨基酸為 TNF 超家族同源區(qū)，同源性主要表現(xiàn)在形成 b 折疊股的序列，在 b 折疊股 c 和 d 之間有一對(duì)保守的二硫鍵，對(duì)其空間結(jié)構(gòu)的形成有作用。但在人的胸腺細(xì)胞中， Fas 只有很微弱的表達(dá)，而在活化淋巴細(xì)胞和 HTLV HIV、 EBV 等病毒感染的淋巴細(xì)胞中高表達(dá)。胞漿中有兩種不同長(zhǎng)度的 Fas mRNA，一種編碼全長(zhǎng)分子，另一個(gè)編碼可溶性分子。這一結(jié)構(gòu)域在其它死亡受體尚未發(fā)現(xiàn)，但其它受體能通過(guò)各自獨(dú)特途徑，對(duì)死亡信號(hào)進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。以后的研究發(fā)現(xiàn)，死亡結(jié)構(gòu)域也存在于其它死亡受體以及一些胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，受體的死亡結(jié)構(gòu)域可以與胞漿信號(hào)蛋白的死亡 結(jié)構(gòu)域發(fā)生同源或異源結(jié)合，所以這個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用是作為一個(gè)接頭將死亡受體與胞漿信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)。根據(jù)氨基酸序列推測(cè) Fas 的 中國(guó)最大的管理資料下載中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 13 頁(yè) 共 68 頁(yè) 分子量為 36kDa，由于糖基化的影響，實(shí)際分子量約43kDa。跨膜區(qū)有 17 個(gè)疏水性氨基酸。 Fas/Apo1 是 I 型跨膜糖蛋白，其蛋白前體長(zhǎng) 335aa， N 端有 16 個(gè)疏水性氨基酸組成的信號(hào)肽，成熟蛋白長(zhǎng) 319aa。同年， Trauth 等也發(fā)現(xiàn)了一株可以誘導(dǎo)活化或惡性變淋巴細(xì)胞凋亡的單克隆抗體，他們將這株抗體所識(shí)別的蛋白稱為凋亡蛋白 1(Apo1)。 (一 )Fas/FasL (二 )TNFRI、 TNFRII、 LTb R 與 TNFa 、 TNFb 、LTb (三 )DR3 (四 )DR DR DcR1 與 TRAIL/Apo2L (五 )CD40 與 CD40L (六 )CD30 與 CD30L (七 )CD27 與 CD27L (八 )OX40 與 OX40L (九 )41BB/ILA 與 41BBL (十 )TNFR 超家族的其它成員 (一 )Fas/FasL Fas 及其配體 FasL 是近年來(lái)研究得最為深入的有關(guān)細(xì)胞凋亡的膜表面分子，闡明它們?cè)诘蛲鲋凶饔脵C(jī)制，對(duì)深入了解細(xì)胞凋亡的機(jī)理起產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。非死亡受體的 TNFR 超家族成員有：低親和力 NGF 受體、淋 巴毒素 b (LTb ) 特異性受體 LTb R、 B 細(xì)胞表面抗原 CD T 細(xì)胞活化抗原 OX 41BB 和 CD2表達(dá)于何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞表面的淋巴活化分子 CD30，以及新發(fā)現(xiàn)的成員 ATAR、 DcR1 等，這些受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后可以引起各自不同的反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、活化等。另外，痘病毒 (poxvirus)產(chǎn)生的兩種蛋白 T2 和 A53R 也屬于 TNFR 超家族。 表 2. TNFR 超家族及其配體分子的表達(dá)形式 受體 可溶形式 多聚體 配體 可溶形式 多聚體 TNFRI 蛋白酶切 同源二 /三聚體 TNFa 蛋白酶切 同源三聚體 Wsl1/DR3 不同拼接 ? Apo2/DR4 Apo2L 蛋白酶切 同源二 /三聚體 NGFR 蛋白酶切 NGF 同源二聚體 TNFRII 中國(guó)最大的管理資料下載中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 10 頁(yè) 共 68 頁(yè) 蛋白酶切 同源二 /三聚體 TNFb 蛋白酶切 同 /異源三聚體 LTb R LTb /LTa 異源三聚體 CD40 蛋白酶切 CD40L 蛋白酶切 同 /異源三聚體 CD30 蛋白酶切 CD30L CD27 蛋白酶切 CD70 Fas/Apo1 不同拼接 FasL 蛋白酶切 同源三聚體 OX40 OX40L 同源三聚體 41BB/ILA 不同拼接 41BBL 同源二聚體 二 TNFR 超家族與 TNF 超家族的成員 死亡受體包括 TNFRI、 Fas、 DR DR DR CAR1 等，它們的共同特征是胞漿區(qū)都有一段 60~80aa 組成的同源結(jié)構(gòu)域，死亡受體通過(guò)這個(gè)結(jié)構(gòu)域與胞漿中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)后者啟動(dòng) 中國(guó)最大的管理資料下載中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 11 頁(yè) 共 68 頁(yè) 細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序，引起細(xì)胞凋亡，所以這個(gè)結(jié)構(gòu)域被稱為死亡結(jié)構(gòu)域。并都有多聚化的傾向，如 TNFa 、 TNFb 、CD40L 都可形成同源三聚體，而 TNFb 與 LTb 可形成異源三聚體， NGF、 41BBL 可以形成同源