【正文】 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 yeast artificial chromosome YAC 酵母人工染色體載體 目前常用的人造染色體載體包括： 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 bacterial artificial chromosome BAC 細菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 The essential elements for chromosome maintenance and transmission are the following three regions: (1) the “replication origin,” from which the duplication of DNA begins, (2) the “centromere,” which functions in proper chromosome segregation during cell division, and (3) the “telomere,” which protects the ends of linear chromosomes A human artificial chromosome (HAC) is a minichromosome that is constructed artificially in human cells 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 P1 artificial chromosomes,PAC, P1 人工染色體 transformationpetent artificial chromosome, TAC, 可轉(zhuǎn)化人工染色體 bacterial artificial chromosome , BIBAC, 雙元細菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Cloning vector Size of insert Standard high copy number plasmid vectors 010 kb Bacteriophage l insertion vectors 010 kb Bacteriophage l replacement vectors 923 kb Cosmid vectors 3044 kb Bacteriophage P1 70100 kb PAC (P1 artificial chromosome) vectors 130150 kb BAC (bacterial artificial chromosome) vectors up to 300 kb YAC (yeast artificial chromosome) vectors Mb 各類典型基因克隆載體的容量 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 酵母人工染色體載體 yeast artificial chromosome, YAC 1983年，美國的 DanaFarber癌癥研究所和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的教授首次在 Nature上發(fā)表文章，報道了構(gòu)建 YAC（ Yeast Artificial Chromosome）庫的過程。 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。 除去 Ti 質(zhì)粒上的其它非必需序列 ， 最大限度地縮短載體的長度； 共整合轉(zhuǎn)化程序 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記多克隆位點重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌農(nóng)桿菌細菌接合 T D N A 區(qū)同源整合農(nóng)桿菌感染植物根部細胞 T D N A 區(qū)整合在植物細胞基因組上二元整合轉(zhuǎn)化程序 LB RBT DN A外源基因植物細胞篩選標(biāo)記 Km r大腸桿菌 農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌 ori大腸桿菌 ori將外源基因克隆在大腸桿菌 農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的 TDNA區(qū)內(nèi)； 重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株 ， 該菌株攜帶只含 vir區(qū)不含 TDNA區(qū)的 Ti輔助質(zhì)粒； 以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細胞 。 vir基因產(chǎn)物將 Ti質(zhì)粒上的 TDNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產(chǎn)物則與單鏈 TDNA結(jié)合形成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細胞。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 第 3節(jié) 植物基因工程載體 Ti 質(zhì)粒 YEP培養(yǎng)基上的根瘤農(nóng)桿菌 LB培養(yǎng)基上的大腸桿菌 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌 農(nóng)桿根瘤菌 （ ）感染所致，其致瘤特性是由該菌細胞內(nèi)的野生 型質(zhì)粒 Ti（ Tumorinducing）介導(dǎo)的。 2700個外殼蛋白分子 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13噬菌體載體體形圖 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13單鏈 DNA噬菌體的生命周期 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 3 單鏈 DNA噬菌體載體 (M13) M13噬菌體載體是一種含單鍵（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λDNA分子具有 兩個 cos位點 ， Ter體系發(fā)生作用的條件 兩個 cos位點之間的距離 38～ 54kb 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 采用柯斯質(zhì)粒作載體的 困難??！ ① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的 1/10左右，常出現(xiàn)載體與載體連接 用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接 ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子 選出 30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，每個載體只可能插入一個外源片段 如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ③ 細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費時間。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒 kb的 lDNA片段 + pBR322片段 裝載范圍為 31 45 kb 考斯質(zhì)粒載體的特點： 能像 lDNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞 裝載量大（ 45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 能像質(zhì)粒那樣在受體細胞 中自主復(fù)制 重組操作簡便，篩選容易 不能體內(nèi)包裝，不裂解 受體細胞 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 柯斯克隆 應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組 DNA技術(shù)，叫做 “柯斯克隆”（ cosmid cloning） 線性 λ噬菌體 DNΑ分子末端 cos位點，在 λ噬菌體的正常生命周期中，會產(chǎn)生由數(shù)百個 λDNA拷貝組成的多連體分子。 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） 1978年， J． Coffins及 B． Hohn等人發(fā)展出柯斯質(zhì)粒載體。 編碼必要基因的 DNA區(qū)段占 28kb 因此， λ載體克隆外源 DNA的 理論極限值應(yīng)是 23kb 按野生型 λDNA分子長度為 48kb計算 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 gateway 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 lDNA及其重組分子的分離純化： 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期 加入 l噬菌體或重組 l噬菌體的懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1小時 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 4 12小時。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 重組分子 尾部基因 琥珀突變型 Sup細菌 尾部基因 提取物 頭部基因 提取物 頭部基因 琥珀突變型 完整的噬菌體 體外互補作用研究 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λ噬菌體 DNA的包裝限制問題 上限不得超過其正常野生型 DNA總量的 5％左右 λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納 DNA的能力是有一定限度的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部，而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部。 轉(zhuǎn)染效率： 每微克 λDNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目 λDNA的轉(zhuǎn)染作用，是一種低效的過程。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 替換型載體克隆外源 DNA可能出現(xiàn)三種情況 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 替換型載體 可承受較大分子量的外源 DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體 DNA 最小裝載長度 10 kb 最大裝載長度 25 kb 體外包裝 體外包裝 插入片段 （ 51 – 26） 載體長度 26 kb 插入片段 （ 36 – 26） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λ重組體 DNA分子的轉(zhuǎn)染作用與體外包裝 λ重組體 DNA分子的轉(zhuǎn)染作用 用 λ重組體 DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細胞內(nèi)。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λNM781感染寫宿主后能在乳糖麥康基氏（ Macconkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生 紅色的噬菌斑 重組 λNM781感染寫宿主后能在乳糖麥康基氏（ Macconkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生 無色的噬菌斑 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 對重組體的 λDN A分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的 λ重組噬菌體。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λNM781載體中，可取代的 EcoRI片段編碼有一個 supE基因，可抑制寄主細胞 lacZ基因的琥珀突變， λNM781感染寫宿主后能在乳糖麥康基氏（ Macconkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出紅色的噬菌斑，或是在 Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 插入型載體 只能承受較小分子量（一般在 10kb左右）的外源DNA片段的插入，應(yīng)用于 cDNA及小片段 DNA的克隆。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 turbid plaques clarification plaques 帶有外源 DNA插入的 λ重組體形成清晰的噬菌斑 （ clarification plaques） 沒有外源 DNA插入的親本噬菌體形成混濁的噬菌斑（ turbid plaques） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 β半乳糖苷酶失活的（ inactlvatlon of βgalactosidase） 基因組中 lacZ