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何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術(shù)與原理(參考版)

2024-09-22 20:34本頁面
  

【正文】 第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序( Sequencing by Synthesis),即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定 DNA的序列 現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括 Roche/454 FLX Illumina/Solexa Genome Analyzer Applied Biosystems SOLID system 454 FLX的測序片段比較長,高質(zhì)量的讀長( read)能達到 400bp Solexa測序性價比最高,不僅機器的售價比其他兩種低,而且運行成本也低,在數(shù)據(jù)量相同的情況下,成本只有 454測序的 1/10 。 學(xué)會利用豐富的網(wǎng)上資源。 集成軟件:如 BioEdit等??捎脺缇?TE Buffer (pH ~ ) 溶解后使用 用途 作為具有 SP6 Promoter載體的測序用引物或 PCR用引物 化學(xué)法測序 (MaxamGilbert procedure) 經(jīng) 凝膠電泳 按大小分離和放射自顯影后,根據(jù) X光片所顯現(xiàn)的相應(yīng)條帶,直接讀出待測 DNA片段的核苷酸順序 是一個 DNA化學(xué)降解的過程,而不是生物合成過程 化學(xué)試劑處理具有 末端標(biāo)記 的 DNA片段,造成堿基的 特異性切割 ,由此產(chǎn)生一組具有各種不同長度的 DNA鏈的反應(yīng)混合物 注意:只能標(biāo)記一個堿基,多堿基標(biāo)記會產(chǎn)生錯誤。根據(jù)重疊序列,通過軟件處理,DNA序列信息 測序載體 pUC:雙鏈質(zhì)粒載體,衍生的載體很多,不同商業(yè)公司有所不同,但基本均由 pUC衍生而來,使用時需先變性 M13系列和 pUC系列的測序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的 DNA M13:單鏈?zhǔn)删w載體,目前很少采用 測序 DNA聚合酶 ① DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段 5′→3′ 的聚合酶活性, 3′→5′ 的外切酶活性 持續(xù)合成能力不強,不能復(fù)制富含二級結(jié)構(gòu)的模板區(qū) 以 ddNTP為底物的能力遠(yuǎn)比在 dNTP低 易受 DNA制備時經(jīng)常產(chǎn)生的污染物的影響,且只對單鏈模板有效 ② T7噬菌體聚合酶 (測序酶 ) 是一種經(jīng)過修飾的 T7噬菌體 DNA聚合酶,缺乏 3′→5′ 外切酶活性 能產(chǎn)生出非常漂亮的 DNA梯帶,每條帶都具有相似的強度,可讀的DNA序列可覆蓋凝膠的全長 測序酶催化 ddNTP結(jié)合的速率是 dNTP的 33% 具有 , ,能對折疊成二級結(jié)構(gòu)的模板起作用 測序酶 526位氨基酸為 Tyr,若換成 Phe,結(jié)合 ddNTP的能力下降2022倍,將 Ⅰ 或 TaqdnaPol類似氨基酸換面 Tyr其結(jié)合 ddNTP的能力提高 8000倍 ③ TaqDNA聚合酶 它在高溫下( 70℃ )進行終止鏈反應(yīng)的能力可減少測序反應(yīng)中由于模板DNA上引物假結(jié)合位點與引物退火錯配產(chǎn)生的相關(guān)問題 在測序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強度不同,從頂部到底部條帶逐漸減弱,出現(xiàn)陰影。產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的 DNA鏈。 3. 各種試劑最好先進行分裝,然后低溫貯存 。 循環(huán)次數(shù) ⑦ PCR實驗操作過程 PCR產(chǎn)物純化 PCR產(chǎn)物純化試劑盒 PCR產(chǎn)物電泳 ⑧ PCR常見問題 正對照有條帶,而樣品則無 原因: 該 Buffer對樣品不合適 引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解 模板 :含有抑制物,含量低 反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時間太短 優(yōu)化 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA 更換 Buffer或調(diào)整濃度 重新設(shè)計引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)) 或者換一管新引物 降低退火溫度、延長延伸時間 非特異性擴增 現(xiàn)象: PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致 ,或大或小 , 或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶 原因: 1. 引物特異性差 2. 酶純度不高 3. Mg2+濃度偏高 4. 退火溫度偏低 5. Buffer不合適 6. 循環(huán)次數(shù)過多 解決: 1. 重新設(shè)計引物或者使用巢式 PCR 2. 換用高純度的酶 3. 降低鎂離子濃度 4. 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 5. 更換 Buffer 6. 減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 現(xiàn)象:產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) 原因: 1. 酶量過多 2. 模板不純 3. 循環(huán)次數(shù)過多 4. dNTP、 Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. Buffer不合適 解決: 1. 適量用酶 2. 純化模板 3. 減少循環(huán)次數(shù) 4. 適當(dāng)降低 dNTP和鎂離子的濃度 5. 適當(dāng)提高退火溫度 6. 更換 Buffer 假陽性 現(xiàn)象: 空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 原因: 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 對策: 1. 操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外 2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。 3~4kb的靶序列需 3~ 4min;擴增 10Kb需延伸至 15min。 延伸溫度與時間: PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70~ 75℃ 之間,常用溫度為 72℃ ,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。復(fù)性時間一般為 30~ 60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。對于 20個核苷酸, G+C含量約 50%的引物, 55℃ 為選擇最適退火溫度的起點較為理想。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。 變性溫度與時間 退火溫度是影響 PCR特異性的較重要因素。一般情況下, 93℃ ~ 94℃ 1min足以使模板 DNA變性,若低于93℃ 則 需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。 ⑤ 引物 Ⅰ 設(shè)計引物的原則 引物長度: 1530bp,常用為 20mer左右 引物的有效長度不能大于 38 mer,否則最適延伸溫度會超過 TaqDNA聚合酶的最適溫度( 74℃ ),不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性 引物擴增跨度:以 500bp為宜 特定條件下可擴增長至 10kb的片段 引物堿基: G+C含量以 4060%為宜 G+C太少擴增效果不佳, G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機分布,避免 5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) 避免兩條引物間互補, 特別是 3’ 端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異性的擴增條帶 ⑤ 引物 3′端的堿基要求嚴(yán)格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致 PCR失敗 ⑥ 引物中有或能加上合適的酶切位點 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處 ⑦ 引物的特異性: 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性 引物量: 每條引物的濃度 ~ 1umol或 10 ~ 100 pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好 引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會 引物的解鏈溫度 兩個引物之間的 Tm 值差異最好在 25℃ Ⅱ 簡并引物設(shè)計( degenerate primers) 如: Asn PheTyr Ala 對應(yīng)的核苷酸序列 (?) AAU UUU UAU GCU AAC UUC UAC GCC 等 N /A T C G Ⅲ 設(shè)計引物的方法 設(shè)計引物的操作流程 同源性比較 序列下載 引物設(shè)計篩選 根據(jù)所需要檢測的基因在 查詢有關(guān)序列 利用 primer premier 同源性比較 中在線比較 采用 OMIGA, PGCENE進行兩兩比較或多序列比較 上游引物 下游引物 發(fā)莢結(jié)構(gòu),點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5,所形成的發(fā)莢結(jié)構(gòu) 3′端為突出端影響較小, 5′端影響較大 引物自身形成二聚體,點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5 引物在目標(biāo)基因序列中間形成錯配的情況,點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 15 上下游引物形成配對的情況,點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于5 這幾個參數(shù)對引物設(shè)計的影響順序: False Priming Hairpin and Cross DimerDimer 得到產(chǎn)物的機率,應(yīng)大于 50% ⑥ PCR反應(yīng)條件的選擇 溫度與時間的設(shè)臵 三溫度點法 雙鏈 DNA在 90~ 95℃ 變性,再迅速冷卻至40 ~ 60℃ ,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至 70~ 75℃ ,在 Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸 (標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng) ) 二溫度點法 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用 94℃ 變性, 65℃ 左右退火與延伸 (此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性 )。 DNA Polymerase ? Stratagene: SureStart? Taq 大大提高 PCR反應(yīng)的特異性 化學(xué)修飾不影響后續(xù)實驗 抗體抑制 ? Invitrogen: AccuPrimeTM Taq Platinum174。 保存: 在 20℃ 至少 6個月。一般出錯率為2 104核苷酸 /每輪循環(huán),利用 PCR克隆、測序時尤應(yīng)注意 抑制劑: 尿素、乙醇、 DMSO、 DMF、甲酰胺、 SDS 及許多其他化學(xué)藥劑 內(nèi)源 DNA: 不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細(xì)菌 DNA或 PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來源的 DNA。mol/L) ③ dNTP ④ 酶及其濃度 Selection for DNA polymerase Klenow酶, 早期采用,該酶不耐熱,缺點有 ①溫度要求低 (37℃ ),受熱即失活; ②產(chǎn)物特異性不高; ③積累大量的失活殘酶,使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低; ④擴增的最長序列約 400bp( Taq酶則能擴增 10kb) thermostable DNA polymerases ① Taq DNA polymerase ② Tth DNA polymerase— from ③ VENT DNA polymerase— from ④ Sac polymerase ⑤ pfu polymerase Taq DNA聚合酶 分離 : 1969年,美國黃石國家公園溫泉 分子量 : 94KDa 活性: 在幾種水生棲熱菌中活性最高, 200 000U/mg 離子需要: 對 Mg2+、單價離子性質(zhì)和濃度較敏感,最適濃度為50mmol/L。 PCR反應(yīng)動力學(xué) Y= (1+ X)n Y:代表 DNA片段擴增后的拷貝數(shù) X:表示平均每次的擴增效率 n:代表循環(huán)次數(shù) 平均擴增效率的理論值為 100%,但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值 每完成一個循環(huán)需 2~ 4分鐘, 2~ 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 到達 平臺期 (Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝 反應(yīng)初期,靶序列 DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著 PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴增的 DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進 入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺效應(yīng) PCR技術(shù)反應(yīng)體系、條件和過程 引物、酶 (熱穩(wěn)定性 DNA聚合酶 )、 dNTP、模板和二價陽離子( Mg2+)、一價陽離子( K+)、緩沖液 ① PCR反應(yīng)的基本成分 10 擴增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物
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