【正文】 第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序（ Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定 DNA的序列 現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括 Roche/454 FLX Illumina/Solexa Genome Analyzer Applied Biosystems SOLID system 454 FLX的測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長（ read）能達到 400bp Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有 454測序的 1/10 。 學(xué)會利用豐富的網(wǎng)上資源。 集成軟件：如 BioEdit等?？捎脺缇?TE Buffer (pH ～ ) 溶解后使用 用途 作為具有 SP6 Promoter載體的測序用引物或 PCR用引物 化學(xué)法測序 (MaxamGilbert procedure) 經(jīng) 凝膠電泳 按大小分離和放射自顯影后，根據(jù) X光片所顯現(xiàn)的相應(yīng)條帶，直接讀出待測 DNA片段的核苷酸順序 是一個 DNA化學(xué)降解的過程，而不是生物合成過程 化學(xué)試劑處理具有 末端標(biāo)記 的 DNA片段，造成堿基的 特異性切割 ，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長度的 DNA鏈的反應(yīng)混合物 注意：只能標(biāo)記一個堿基，多堿基標(biāo)記會產(chǎn)生錯誤。根據(jù)重疊序列，通過軟件處理，DNA序列信息 測序載體 pUC：雙鏈質(zhì)粒載體，衍生的載體很多，不同商業(yè)公司有所不同，但基本均由 pUC衍生而來，使用時需先變性 M13系列和 pUC系列的測序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的 DNA M13：單鏈?zhǔn)删w載體，目前很少采用 測序 DNA聚合酶 ① DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段 5′→3′ 的聚合酶活性， 3′→5′ 的外切酶活性 持續(xù)合成能力不強，不能復(fù)制富含二級結(jié)構(gòu)的模板區(qū) 以 ddNTP為底物的能力遠(yuǎn)比在 dNTP低 易受 DNA制備時經(jīng)常產(chǎn)生的污染物的影響，且只對單鏈模板有效 ② T7噬菌體聚合酶 (測序酶 ) 是一種經(jīng)過修飾的 T7噬菌體 DNA聚合酶，缺乏 3′→5′ 外切酶活性 能產(chǎn)生出非常漂亮的 DNA梯帶，每條帶都具有相似的強度，可讀的DNA序列可覆蓋凝膠的全長 測序酶催化 ddNTP結(jié)合的速率是 dNTP的 33% 具有 ， ，能對折疊成二級結(jié)構(gòu)的模板起作用 測序酶 526位氨基酸為 Tyr，若換成 Phe，結(jié)合 ddNTP的能力下降2022倍，將 Ⅰ 或 TaqdnaPol類似氨基酸換面 Tyr其結(jié)合 ddNTP的能力提高 8000倍 ③ TaqDNA聚合酶 它在高溫下（ 70℃ ）進行終止鏈反應(yīng)的能力可減少測序反應(yīng)中由于模板DNA上引物假結(jié)合位點與引物退火錯配產(chǎn)生的相關(guān)問題 在測序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強度不同，從頂部到底部條帶逐漸減弱，出現(xiàn)陰影。產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的 DNA鏈。 3. 各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存 。 循環(huán)次數(shù) ⑦ PCR實驗操作過程 PCR產(chǎn)物純化 PCR產(chǎn)物純化試劑盒 PCR產(chǎn)物電泳 ⑧ PCR常見問題 正對照有條帶，而樣品則無 原因： 該 Buffer對樣品不合適 引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解 模板 :含有抑制物，含量低 反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短 優(yōu)化 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA 更換 Buffer或調(diào)整濃度 重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)） 或者換一管新引物 降低退火溫度、延長延伸時間 非特異性擴增 現(xiàn)象： PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致 ，或大或小 ， 或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶 原因： 1. 引物特異性差 2. 酶純度不高 3. Mg2+濃度偏高 4. 退火溫度偏低 5. Buffer不合適 6. 循環(huán)次數(shù)過多 解決： 1. 重新設(shè)計引物或者使用巢式 PCR 2. 換用高純度的酶 3. 降低鎂離子濃度 4. 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 5. 更換 Buffer 6. 減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) 原因： 1. 酶量過多 2. 模板不純 3. 循環(huán)次數(shù)過多 4. dNTP、 Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. Buffer不合適 解決： 1. 適量用酶 2. 純化模板 3. 減少循環(huán)次數(shù) 4. 適當(dāng)降低 dNTP和鎂離子的濃度 5. 適當(dāng)提高退火溫度 6. 更換 Buffer 假陽性 現(xiàn)象： 空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 原因： 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 對策： 1. 操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外 2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 3～4kb的靶序列需 3～ 4min；擴增 10Kb需延伸至 15min。 延伸溫度與時間： PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70～ 75℃ 之間，常用溫度為 72℃ ，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。復(fù)性時間一般為 30～ 60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。對于 20個核苷酸， G+C含量約 50%的引物， 55℃ 為選擇最適退火溫度的起點較為理想。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。 變性溫度與時間 退火溫度是影響 PCR特異性的較重要因素。一般情況下， 93℃ ～ 94℃ 1min足以使模板 DNA變性，若低于93℃ 則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。 ⑤ 引物 Ⅰ 設(shè)計引物的原則 引物長度： 1530bp，常用為 20mer左右 引物的有效長度不能大于 38 mer，否則最適延伸溫度會超過 TaqDNA聚合酶的最適溫度（ 74℃ ），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性 引物擴增跨度：以 500bp為宜 特定條件下可擴增長至 10kb的片段 引物堿基： G+C含量以 4060%為宜 G+C太少擴增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機分布，避免 5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) 避免兩條引物間互補， 特別是 3’ 端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶 ⑤ 引物 3′端的堿基要求嚴(yán)格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致 PCR失敗 ⑥ 引物中有或能加上合適的酶切位點 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處 ⑦ 引物的特異性： 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性 引物量： 每條引物的濃度 ~ 1umol或 10 ~ 100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好 引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會 引物的解鏈溫度 兩個引物之間的 Tm 值差異最好在 25℃ Ⅱ 簡并引物設(shè)計（ degenerate primers) 如： Asn PheTyr Ala 對應(yīng)的核苷酸序列 (?) AAU UUU UAU GCU AAC UUC UAC GCC 等 N /A T C G Ⅲ 設(shè)計引物的方法 設(shè)計引物的操作流程 同源性比較 序列下載 引物設(shè)計篩選 根據(jù)所需要檢測的基因在 查詢有關(guān)序列 利用 primer premier 同源性比較 中在線比較 采用 OMIGA， PGCENE進行兩兩比較或多序列比較 上游引物 下游引物 發(fā)莢結(jié)構(gòu)，點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5，所形成的發(fā)莢結(jié)構(gòu) 3′端為突出端影響較小， 5′端影響較大 引物自身形成二聚體，點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5 引物在目標(biāo)基因序列中間形成錯配的情況，點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 15 上下游引物形成配對的情況，點擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于5 這幾個參數(shù)對引物設(shè)計的影響順序： False Priming Hairpin and Cross DimerDimer 得到產(chǎn)物的機率，應(yīng)大于 50% ⑥ PCR反應(yīng)條件的選擇 溫度與時間的設(shè)臵 三溫度點法 雙鏈 DNA在 90～ 95℃ 變性，再迅速冷卻至40 ～ 60℃ ，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至 70～ 75℃ ，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸 (標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng) ) 二溫度點法 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用 94℃ 變性， 65℃ 左右退火與延伸 (此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性 )。 DNA Polymerase ? Stratagene: SureStart? Taq 大大提高 PCR反應(yīng)的特異性 化學(xué)修飾不影響后續(xù)實驗 抗體抑制 ? Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum174。 保存： 在 20℃ 至少 6個月。一般出錯率為2 104核苷酸 /每輪循環(huán)，利用 PCR克隆、測序時尤應(yīng)注意 抑制劑： 尿素、乙醇、 DMSO、 DMF、甲酰胺、 SDS 及許多其他化學(xué)藥劑 內(nèi)源 DNA： 不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細(xì)菌 DNA或 PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來源的 DNA。mol/L） ③ dNTP ④ 酶及其濃度 Selection for DNA polymerase Klenow酶， 早期采用，該酶不耐熱，缺點有 ①溫度要求低 (37℃ )，受熱即失活； ②產(chǎn)物特異性不高； ③積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低； ④擴增的最長序列約 400bp（ Taq酶則能擴增 10kb） thermostable DNA polymerases ① Taq DNA polymerase ② Tth DNA polymerase— from ③ VENT DNA polymerase— from ④ Sac polymerase ⑤ pfu polymerase Taq DNA聚合酶 分離 : 1969年，美國黃石國家公園溫泉 分子量 : 94KDa 活性： 在幾種水生棲熱菌中活性最高， 200 000U/mg 離子需要： 對 Mg2+、單價離子性質(zhì)和濃度較敏感，最適濃度為50mmol/L。 PCR反應(yīng)動力學(xué) Y＝ (1＋ X)n Y：代表 DNA片段擴增后的拷貝數(shù) X：表示平均每次的擴增效率 n：代表循環(huán)次數(shù) 平均擴增效率的理論值為 100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值 每完成一個循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 到達 平臺期 (Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝 反應(yīng)初期，靶序列 DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著 PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的 DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺效應(yīng) PCR技術(shù)反應(yīng)體系、條件和過程 引物、酶 (熱穩(wěn)定性 DNA聚合酶 )、 dNTP、模板和二價陽離子（ Mg2+）、一價陽離子（ K+）、緩沖液 ① PCR反應(yīng)的基本成分 10 擴增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物