【正文】 病毒毒價測定方法多采用TCID50、中和試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、血凝試驗、ELISA14。有些病毒在細(xì)胞上增殖并不產(chǎn)生CPE，如豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒等。如正黏病毒、冠狀病毒、彈狀病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒等。如副黏病毒和皰疹病毒。如腺病毒。如痘病毒和腸孤病毒等。如腺病毒、馬立克氏病毒和流感病毒，均受利用精氨酸的支原體所抑制。（2）病毒、支原體對共同營養(yǎng)需求成分的競爭。支原體污染影響病毒增殖的機(jī)制有兩種：（1）干擾素誘導(dǎo)與干擾素活性抑制。此外呼吸道合胞體病毒、魚傳染性胰腺壞死病毒和傳染性出血熱病毒也可因支原體污染而增加產(chǎn)毒量。如痘病毒、犬瘟熱病毒、馬立克病毒和新城疫病毒等，均能被雞毒支原體所抑抑制。同步接毒是在種植細(xì)胞的同時或在種植細(xì)胞后4h內(nèi)將病毒接入，主要用于病毒復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂盛期的病毒，如細(xì)小病毒等。異步接毒是指細(xì)胞長成單層后倒去生長液，按維持液的1%－10%（V/V）量接毒，37℃吸附1h后加入維持液?？茖W(xué)的接種量應(yīng)以TCID50為依據(jù)。接種量小，細(xì)胞不能完全發(fā)生感染，會影響毒價；接種量過大，會產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒，如水泡病毒。如果維持液pH下降過快或過低，%NaHCO3液調(diào)整，如腺病毒細(xì)胞培養(yǎng)，由于感染細(xì)胞的有絲分裂受阻，糖酵解增高，產(chǎn)酸量增高，維持液pH下降很快。但大部分病毒感染細(xì)胞后需要3~7d才會出現(xiàn)明顯病變，在此期間維持也重酸性物質(zhì)仍可蓄積較多，導(dǎo)致維持液pH降至很低。（3）pH 細(xì)胞在生長過程中產(chǎn)生各種酸類物質(zhì)，使生長液pH下降。有些病毒的量適溫度或高于37℃，如狂犬病病毒適宜溫度為30－40℃，最適宜溫度為32℃；犬皰疹病毒量適宜增殖溫度為35－37℃，通常用36℃；阿留申病毒在31。為降低血清對病毒增殖的抑制，有時用高嶺土或受體破壞酶（RDE）處理可起到一定效果。為了克服血清中非特異性抑制因子的作用，病毒維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過2%。但是，血清中存在一些非特異性抑抑制因子，它們對某些病毒的生長和增殖有抑制作用，經(jīng)56℃30min不能被滅活。通常病毒的細(xì)胞感染譜是通過試驗獲得的（）同一病毒在不同敏感細(xì)胞增殖后其毒價不盡相同．２．細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素　　　　病毒在敏感細(xì)胞上增殖需要一定條件，包括維持液、犢牛血清量、溫度、PH、病毒接毒量和方法等，只有在最佳條件下，病毒才能大量增殖，毒價才會最高。如增殖口蹄疫病毒可選擇牛、豬或地鼠細(xì)胞；馬傳染性貧血病毒選擇馬屬動物的細(xì)胞等。此外，對SP2/0等腫瘤細(xì)胞可腹腔注射小鼠，利用巨噬細(xì)胞殺死部分膠原蟲，然后再抽取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)檢驗。此外，在犢牛血清中，有時會發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞培養(yǎng)有害的膠原蟲，一旦經(jīng)污染就難于消除。細(xì)胞一旦污染病毒，就很難排除。病毒污染后細(xì)胞往往出現(xiàn)病變。（2 ）培養(yǎng)液帶毒。其來源有：（1）組織帶毒。這些方法在一定程度上能降低支原體在細(xì)胞培養(yǎng)中的滴度，但很難徹底清除。迄今尚無消除支原體污染的簡便方法。支原體污染可多方面影響細(xì)胞的功能和活力，如引起細(xì)胞產(chǎn)生病變、競爭細(xì)胞的營養(yǎng)、抑制或刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、造成細(xì)胞染色體缺損及促進(jìn)或抑制病毒增殖等。３．支原體污染　　支原體在細(xì)胞培養(yǎng)中最常見，不易察覺，危害較大。念珠菌或酵母菌污染后鏡檢可見卵圓形菌分散于細(xì)胞周邊和懸浮于營養(yǎng)液內(nèi)，有折光性。２．真菌污染　　也與消毒不徹底和操作不嚴(yán)格有關(guān)。常見的污染有大腸桿菌、假單細(xì)胞菌和葡萄球菌等。但微生物的污染最常見，化學(xué)物污染較少，而細(xì)胞交叉污染近幾年來隨著細(xì)胞種類的增多也有發(fā)生。 此外，成功的細(xì)胞培養(yǎng)還需要嚴(yán)格的無菌操作及潔凈的培養(yǎng)器皿。５ 溫度 細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜溫度應(yīng)與細(xì)胞來源的動物提溫一致，在此基礎(chǔ)上，如升高2~3℃，則對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，甚至在24h死亡。細(xì)胞代謝產(chǎn)生的各種酸性物質(zhì)可使PＨ下降，而培養(yǎng)液中的ＮaＨＣＯ３產(chǎn)生ＣＯ２又使PＨ增高。4 PＨ －,但量適PH YL －。此外，細(xì)胞接種量和形成單層的速度也有關(guān)，接種細(xì)胞數(shù)量越大，細(xì)胞生長為單層的速度越快，但細(xì)胞過多對細(xì)胞生長也不利。多數(shù)無血清培養(yǎng)液須補(bǔ)加3－8種血清替代因子。常用的基礎(chǔ)液為MEM、19DMEM、F1RPMI16DMEM+F12（1：1，稱SFFD）和RPMI1640+DMEM+F12（2：1：1，稱RDE等。目前國內(nèi)外正在研制無血清培養(yǎng)液，以避免血清中某些物質(zhì)對細(xì)胞生長和病毒復(fù)制的影響。維持液中血清量為0％－5％。生長液血清含量一般為５%－２０％。實踐證明，同種動物優(yōu)于異種動物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清又優(yōu)于兔血清和雞血清。此外，血清中的一些濾過物質(zhì)乃是刺激和促進(jìn)細(xì)胞生長的重要因子。球蛋白和白蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長，刺激細(xì)胞的生長活力；白蛋白具有解除脂肪酸、胰酶及金屬離子等的毒性作用。血清中除了含有細(xì)胞生長的部分氨基酸外，還有促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。不同培養(yǎng)液適用于不同細(xì)胞，乳漢液多用于雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)；Eagle液主要適用于各種二倍體細(xì)胞，是最常用的細(xì)胞培養(yǎng)液，RPMI16MEM液主要用于傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。合成培養(yǎng)液有多種，如Eagle氏液、RPMI16MEM和199等，各有其特點和適用范圍。通常，每凍存１a應(yīng)再復(fù)蘇１次。必要時待細(xì)胞完全貼壁后換液一次，以防止殘留的DMSO對細(xì)胞有害。復(fù)蘇時要求快速融化以防止損害細(xì)胞。常用冷凍速度為每分鐘下降1－２℃，當(dāng)當(dāng)溫度達(dá)25℃時，速度可增至5－１０℃/min，到100℃時則可迅速浸入液氮中。DMSO終濃度為5%－15%，常用10%。 3細(xì)胞凍存于復(fù)蘇細(xì)胞株與細(xì)胞系均需要保存于液氮中（196℃）。單層細(xì)胞經(jīng)EDTA胰酶消化，洗滌2~3次，再加入少量消化液消化，待細(xì)胞剛剛圓縮時即可加入營養(yǎng)液輕輕吹打，使之分散為單細(xì)胞?！?2 傳代細(xì)胞的制備 單層細(xì)胞傳代時多采用FDTA（乙二胺四乙酸二鈉）胰酶消化法，%,其作用是消化細(xì)胞間的組織蛋白。系統(tǒng)由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)及容器、供養(yǎng)其和蠕動泵組成（四）單細(xì)胞的制備 1 原代細(xì)胞的制備 原代細(xì)胞制備時首先選取適當(dāng)組織或器官，如雞胚體、犢牛睪丸、乳豬腎等，采用機(jī)械分散法如剪碎、擠壓等使之成為小塊（約為1mm3 ）%－%胰酶(－)消化掉細(xì)胞間的組織蛋白,消化的時間長短與溫度、組織的來源及大小等有關(guān)，一般37℃ 消化10－30min，４℃消化需要過夜。對于正常細(xì)胞（貼壁依賴性細(xì)胞）某些傳代細(xì)胞不適用，這些細(xì)胞在懸浮下很快死亡。例如扁瓶 37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)板 一般需在含5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)。本廠傳代細(xì)胞有CRFK F81 DK MARC—104 MARC 145 PK15 BHK21 CHO VERO HELA（三）細(xì)胞培養(yǎng)的方法 1 靜止培養(yǎng) 將細(xì)胞懸液接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中置于恒溫箱內(nèi)或溫室中靜止培養(yǎng)，細(xì)胞成長繁殖成單層或克隆。通過細(xì)胞培養(yǎng)挑選產(chǎn)生的空斑（蝕斑）可達(dá)到克隆的目的（二）細(xì)胞培養(yǎng)的類型 1原代細(xì)胞（primary cell）動物組織