【正文】 DNA STAIN: PI,RNAase):上述細(xì)胞內(nèi)加入 LPR 100 ul,室溫避光 20 MIN,再加入 DNA STAIN 1000 ul,室溫避光20 MIN,上機(jī)檢測(cè) . 使用酒精固定和 PI: 上述細(xì)胞內(nèi)加入 70%預(yù)冷酒精 ,4 C過(guò)夜 。 方案（ Protocol） 細(xì)胞周期檢測(cè) 1. 細(xì)胞制備和染色 : 收獲細(xì)胞并 PBS 洗滌 ,10*46 個(gè) ,染色過(guò)程之前要經(jīng)過(guò)100300 目濾網(wǎng)過(guò)濾 ,離心棄上清待用 。當(dāng) Th細(xì)胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中 Th0 即會(huì)向 Thl 或 Th2 大量分化，此時(shí)我們檢測(cè)到的 IFNγ 和 IL4 也較多。 Thl 為 IFNγ +， Th2 為 IL4+。 % ThO ： 177。 ●淋巴細(xì)胞在 FS／ SSC 散點(diǎn)圖中位置，即 A 門(mén)內(nèi)細(xì)胞； ● A 門(mén)內(nèi) CD4 陽(yáng)性細(xì)胞，即 B 門(mén)內(nèi)細(xì)胞； ● B 門(mén)內(nèi) TH 細(xì)胞亞群分布： 1 區(qū)數(shù)值 Th 1 細(xì)胞 (%) 4 區(qū)數(shù)值 Th 2 細(xì)胞 (%) 2 區(qū)數(shù)值 Th 0 細(xì)胞 (%) 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù) 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個(gè)熒光素分子 正常參考值 Thl(IFNγ )： 177。將細(xì)胞分成兩管，其一為測(cè)定管加入抗人 IL4PE 和 IFNγ FITC，另一管加入同型對(duì)照，室溫避光20 分鐘， PBS 洗滌一次，待測(cè)。 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作 ： 細(xì)胞培養(yǎng)與染色 取 200ul 抗凝血加入 lOul CD4PC5 單抗，室溫避 光孵育 30 分鐘， RPMIl640洗滌一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中， 5％ C02 37℃孵育 18 小時(shí)，取出后以 PBS洗一次。 單克隆抗體 CD4— PC IL4PE、 IFNγ FITC 選自美國(guó) BeckmanCoulter 公司。 試劑 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系 (自配 ) 成分：刺激素 PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、 1640 液。若 109/L， 樣本需要稀釋?zhuān)?PBS 稀釋?zhuān)蝗? 109/L，應(yīng)分離單個(gè)核 細(xì)胞。 2．樣本應(yīng)在采集后 6 小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。淋巴細(xì)胞活化以后 才分泌細(xì)胞因子，且迅速分泌到細(xì)胞外。 11．上機(jī)測(cè)樣 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù) 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個(gè)熒光素分子 參考值 CD34+5% MPO+5% 粒系 20% 淋系 30% 臨床意義 用于血液病的診斷和分型診斷 方案（ Protocol） T 細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFNγ /IL4 檢測(cè) (流式細(xì)胞儀 ) 醫(yī)院檢驗(yàn)科 操作規(guī)程文件號(hào)： 200 年 月 日起實(shí)施 第 1 版 (共 3 頁(yè) ) 本規(guī)程每 2 年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫(xiě)者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部 門(mén)和／或個(gè)人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFNγ /IL4檢測(cè) 方法 流式細(xì)胞儀 (BeckmanCoulter， 貝克曼庫(kù)爾特 ) 原理 ： 直接免疫熒光法。 9． 300g 離心 5 分鐘后，棄去上清液。 7．加抗體，陰性對(duì)照管中加入 10ul，其余各管加入相應(yīng)抗體各 10ul，室溫避光 15 分鐘。 5． 300g 離心 5 分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。 3．每管中加入固定液 100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光 15 分鐘。 2．首先每管中加入標(biāo)本 (骨髓或外周血 )100ul(根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定 )，5ulCD45PC5 抗體。 5．溶血： a. OptiLyse C(按說(shuō)明書(shū)步驟溶血 ) b. 使用 COULTER Q— PREP 制備系統(tǒng) 開(kāi)機(jī) 顯示 READY 燈亮 選擇 35SEC 燈亮 開(kāi) 門(mén) 放入試管關(guān)門(mén) 自動(dòng)進(jìn)行溶血 顯示 READY 燈亮 開(kāi)門(mén) 取出試管再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。 2．首先每管中加入 5ul CD45PC5 抗體。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特 成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 1ML 2— 8℃ 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲 醛 液體 14ML 室溫 3： IntraPrep Permeabilization Reagent 成分 1（固定劑） 液體 5ml 室溫 成分 2（透膜劑） 液體 5ml 室溫 4：鞘液 液體 20L 室溫 5：清洗液 液體 5L 室溫 6：熒光微球 液體 10ML 28℃ 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER 產(chǎn)品，未開(kāi)瓶的試劑于 28℃保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于 28℃可穩(wěn)定 2 周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。若 109/L， 樣本需要稀釋?zhuān)?PBS 稀釋?zhuān)蝗? 109/L，應(yīng)分 離單個(gè)核 細(xì)胞。 2．樣本應(yīng)在采集后 6 小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本或已固定的標(biāo)本不能用。根據(jù)分型需要，選擇相應(yīng)抗原的標(biāo)記抗體，一般 FITC 標(biāo)記抗體和 PE 標(biāo)記抗體搭配為一組，再加 PC5 標(biāo)記抗原 CD45 單克隆抗體，共三 種抗體加入一管 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)，腰穿采骨髓。利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)血液或骨髓進(jìn)行染色，通過(guò) FCM 對(duì)白血病細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原進(jìn)行分析，由此了解所測(cè)白血病細(xì)胞的系列屬性及其分化程度。 3)混勻，避光，室溫孵育 2030 分鐘，洗滌離心 4)上機(jī)測(cè)樣 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù) 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個(gè)熒光素分子 參考值 IgA% IgG% IgM% IgD% 臨床意義 白細(xì)胞減少癥的分型診斷，大多數(shù)白細(xì)胞減少癥患者抗體為陽(yáng)性 方案（ Protocol）