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人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊第五版下(參考版)

2024-11-12 12:08本頁面
  

【正文】 根據(jù)精子制備過程 條件來選擇培養(yǎng)基的緩沖體系,例如,總體上講檢驗(yàn)精子功能分析試。操作過程中試管蓋子保持松開有利于氣體交換。如果培養(yǎng)箱中僅使用空氣,溫度維持在 37℃,培養(yǎng)基應(yīng)該采用 HEPES 或類似緩沖體系,操作過程中試管蓋子擰緊。 精子制備的一般原則 在下文介紹的三種簡單精子制備技術(shù)中,所用的培養(yǎng)基都包含平衡鹽溶液,蛋白質(zhì),以及針對精子處理過程中的不同環(huán)境的 緩沖體系。精子制備技術(shù)不能被認(rèn)為百分百有效的從精子中移走具有傳染性的微生物,操作中要嚴(yán)格遵守附件 2 的生物安全指南。這兩種方法獲得的精子制備物中含有不同量精漿成分,用前列腺分 泌的鋅作指標(biāo),發(fā)現(xiàn)直接上游法處理精液時(shí)精漿鋅擴(kuò)散到上層培養(yǎng)液的量及時(shí)間與放置的時(shí)間成正比,最后獲得的鋅濃度遠(yuǎn)比密度梯度離心高。改變實(shí)驗(yàn)室的推薦離心時(shí)間和離心力,在進(jìn)行臨床應(yīng)用前必須進(jìn)行嚴(yán)格測試,檢測精子制備技術(shù)的最佳方法是精子的功能試驗(yàn),如去透明帶倉鼠卵穿透試驗(yàn)。直接上游法常用接近正常的精液標(biāo)本;而對于嚴(yán)重少弱畸形精子癥的精液標(biāo)本,優(yōu)先使用密度梯度離心法,這樣才能回收到足夠量的正常精子。 Johnson et al., 1996)。直接用培養(yǎng)基稀釋精液后離心仍是 IUI 富集精子常用方法 (Boomsma et al., 2020),但對于一些有一個(gè)或幾個(gè)參數(shù)異常精液,密度梯度離心和直接上游法更常用 (see . Morshedi et al., 2020)。但當(dāng)天然屏障被輔助生育技術(shù)如人工授精( IUI)、體外受精( IVF)克服時(shí),精漿中某些成分(前列腺素、鋅)對獲得妊娠產(chǎn)生阻礙作用。 注釋 2:用于分析的精液量越少,用于計(jì)數(shù)的精子數(shù)越少時(shí)結(jié)果的精確性將明顯降低,當(dāng)計(jì)數(shù)的精子數(shù)目少于 400 時(shí),應(yīng)報(bào)告所計(jì)數(shù)精子數(shù)目的抽樣誤差(見表 )。 注釋 1:精液分析時(shí)如果計(jì)數(shù)精子數(shù)目太少可能會得到不可靠的結(jié)果(見附錄 章節(jié) ),進(jìn)而對診斷和治療產(chǎn)生不良影響(見附錄 章節(jié) )。 第 5 章 精子制備技術(shù) 引言 由于各種不同的目的如精子功能試驗(yàn)、人工授精和輔助生育技術(shù)中的精子回收等,精子必須要從精漿中分離出來。 圖 . 包含人精子的去透明帶倉鼠卵細(xì)胞相差顯微鏡圖片 粗箭頭表示卵胞漿內(nèi)出現(xiàn)的解聚精子頭,細(xì)箭頭指向卵細(xì)胞表面尚未穿透的精子。 Wixon, 2020)。這些試驗(yàn)可為預(yù)測標(biāo)準(zhǔn) IVF的授精率提供補(bǔ)充信息,甚至可能預(yù)測自然妊娠率。新方法包括一些可以評估 DNA 斷裂程度的試驗(yàn),如 TdT 介導(dǎo)的 dUTP DNA 末端標(biāo)記法( TUNEL(原位末端標(biāo)記, ISEL),彗星實(shí)驗(yàn)以及精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)( SCD)。 精子染色質(zhì)分析 檢測精子染色質(zhì)或 DNA 的正常性有幾種方法。這可以提示精子群體中發(fā)生頂體反應(yīng)的比率。(見 Fig ) 7.記錄至少有 1 條精子穿透的卵細(xì)胞所占百分比,以及每個(gè)卵細(xì)胞內(nèi)穿透的精子數(shù)。 5.相差顯微鏡 200 倍放大倍數(shù)下檢測每個(gè)卵細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀察解聚的精子頭部時(shí),需要將卵細(xì)胞很好地鋪平。 2.放一小滴包含卵細(xì)胞的 BWW液于 4 個(gè)小柱的中央。 9.在 BWW 液內(nèi),用火焰上拉的巴斯德吸管通過吹打,洗滌去除卵細(xì)胞上粘附松散的精子。 7.配子置于 37℃, 5%( v/v) CO2 環(huán)境下,孵育 3 小時(shí)。 5.重復(fù)步驟 3,直到所有卵細(xì)胞都被轉(zhuǎn)入精液微滴。玻璃吸管維持正壓以阻止礦物油倒吸,同時(shí)注意不要向精液微滴內(nèi)吹打出氣泡。 2. 玻璃吸管吸取 5 枚卵細(xì)胞,用盡可能少的液體將其轉(zhuǎn)入精液微滴,使精液微滴盡量不被稀釋。 配子的共孵育 1.將去除透明帶的卵細(xì)胞分別放入幾個(gè)精子懸液微滴中,每滴放 5 枚卵細(xì)胞。當(dāng)玻璃管開始融化時(shí),兩手快速向相反方向拉伸使玻璃管被拉長、口徑變細(xì)。如果暫時(shí)不用,卵細(xì)胞可在4℃保存 24 小時(shí)備用。 6.用 BWW 液洗滌卵細(xì)胞 3 次以上。 5.室溫下,用 1%胰酶( 10 000IU/ml)消化卵細(xì)胞 1 分鐘以去除透明帶。 4.將獲取的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的 BWW 液滴( 37℃平衡)內(nèi),洗滌 2 次。解剖顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞分離的情況。 卵細(xì)胞的獲取與處理 1.用針頭和鑷子將卵丘復(fù)合物收集并放置到一個(gè)表面玻璃盤,滴試板或其它淺盤里,盤中事先加熱 37℃, CO2 平衡過、含 %(1 g/l)透明質(zhì)酸酶( 300500IU/ml)的 BWW 液。卵丘復(fù)合物將從刺破處溢出。 收集卵丘復(fù)合物 1.在解剖顯微鏡下通過透視檢查卵 巢,在輸卵管的膨大部位找到卵丘復(fù)合物。切下卵巢,放入裝有 BWW 液( 37℃預(yù)溫)的 Petri 盤中。 6.用鑷子夾住雙角子宮的一邊,將其拉出腹腔外以暴露輸卵管、卵巢及卵巢韌帶。 4.用 95%酒精擦拭鑷子和剪刀,擦凈上面的毛發(fā)。 2.倉鼠腹部朝上放置,用 95%( v/v)酒精蘸濕腹部皮毛。注射每只動物都更換針頭,這樣易于穿透皮膚并減輕動物的不適。 4872 小時(shí)后,經(jīng)腹腔再注射 40 單位的 hCG。小量分裝后儲存于 20℃?zhèn)溆谩? 框 倉鼠誘導(dǎo)排卵 確保注射活 體動物的流程都符合法律程序。 12.將精子液滴用礦物油覆蓋,詳細(xì)描述見 , 步驟 11。 活動精子密度低于 1 106/ml 時(shí)仍可以獲得有效結(jié)果( Aitken amp。 10.評估精子活動率。 8. 500g 離心細(xì)胞 5 分鐘。 6.分別加入 和 A23187 儲存液( 1 mmol/l)至 1 ml 精子懸液中,達(dá)到 和。 4.棄去沉淀上方大部分上清液,輕輕吹打重懸沉淀物。 2.從 80%密度的梯度離心液底部吸取沉淀物,并轉(zhuǎn)移至 8ml BWW 液中。l 精子懸液,緩慢地加入到一個(gè)小的 Petri 盤中;用一次性吸頭吸取已經(jīng)預(yù)溫并在 CO2 孵箱中平衡好的礦物油覆蓋液滴,小心操作不要攪動精子液滴,并保證加入足夠的礦物油以覆蓋每一滴精子懸液。 10.在培養(yǎng)液中調(diào)整活動精子密度至 106/ml。 8.將試管復(fù)原到垂直位,放置 20 分鐘使獲能后不動的精子沉淀下來。(將試管蓋子擰松以利于氣體交換 )。角,以增加氣體交換面積。(見 節(jié)和 節(jié)) 5.在約 培養(yǎng)液中將精子密度稀釋至約 10 106/ml。 3.棄去大部分上清液,留下沉淀。 不用鈣離子載體的標(biāo)準(zhǔn)方案 1.將精液標(biāo)本混合均勻。(見框 ) 8.二甲基亞砜( DMSO)。 4.蠟塊(融點(diǎn)為 4866℃)。 2.透明質(zhì)酸酶( 300500IU/mg)。另一種方法是使用 A23187 激發(fā)的精子,該方法在文中亦有所描述。盡管如此,穿卵試驗(yàn)仍可以反應(yīng)獲能精子頭部質(zhì)膜與卵細(xì)胞膜發(fā)生融合能力的信息。 注釋:常規(guī)穿卵試驗(yàn)是依賴精子的自發(fā)性頂體反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的,這需要延長精子在體外的孵育時(shí)間。倉鼠卵母細(xì)胞穿透( HOP)試驗(yàn),或稱精子穿透試驗(yàn),由于去除了透明帶,因此它不等同與生理狀態(tài)。 2.為確保每次新配制的染料配制適當(dāng),必須用舊染料染色已知反應(yīng)的陽性質(zhì)控精子來進(jìn)行交叉試驗(yàn)。 5.質(zhì)控值> 15%以上,指示發(fā)生了自發(fā)的過早頂體反應(yīng)。 3.值< 10%則為異常。 評分 1.離子載體激發(fā)的頂體反應(yīng) (ARIC)為試驗(yàn) %AR 減去質(zhì)控 %AR。 14. 450490 nm 激發(fā),在 400 熒光顯微鏡下評估熒光標(biāo)記染色的精子。 12.將固定的精子移至干凈的顯微鏡載玻片上,空氣干燥。 11. 加入 100181。 將兩管在 37℃孵育 15 分鐘。 8.質(zhì)控管中加入 10181。l A23187 原液 (1 mmol/l),使終濃度為 10181。如果沒有 CO2孵育箱,可用 Hepes緩沖液 (見附錄 4, 小節(jié),注 1),試管緊蓋,37℃下孵育。 5.準(zhǔn)備一個(gè)質(zhì)控管和一個(gè)實(shí)驗(yàn)管,每管含 1 106 活動精子 /1ml 懸液。 3.培養(yǎng)液在使用前應(yīng) 37℃溫?zé)?,最好在?5% (v/v)CO2 空氣的孵育箱內(nèi)進(jìn)行。 步驟 1.新鮮精液放置 3060 分鐘,使之完全液化。 3.二甲基亞砜 (DMSO)。 試劑 1.含 % (35 g/l)人血清白蛋白( HAS)的 Ham, s F10 培養(yǎng)液(見附錄 4, 小節(jié))。使用鈣離子載體誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流,以檢測獲能精子發(fā)生頂體反應(yīng)的能力。 誘導(dǎo)頂體反應(yīng)測定 頂體反應(yīng)( AR)是精子與透明帶結(jié)合之后,發(fā)生在細(xì)胞外的過程,它一定發(fā)生在精子穿透卵母細(xì)胞膜并使卵母細(xì)胞授精之前。如差異太大,再評價(jià)第二張載玻片。 4.依據(jù)附錄表 或圖 來確定差異的可接受性。 2.每張載玻片檢測 200 條精子,可獲得較低的采樣誤差。 圖 豌豆凝集素?zé)晒馊旧娜祟惥? 圖中 AI(頂體完整)標(biāo)識精子為 頂體區(qū)染色之精子, AR(頂體反應(yīng))標(biāo)識精子為赤道板或?qū)旙w區(qū)域染色之精子。 2.頂體反應(yīng) (AR):精子在赤道段僅有一個(gè)熒光帶,或者在頂體區(qū)無熒光著色。 評分 450490nm 激發(fā),在 400 熒光光學(xué)顯微油鏡下觀察。 注意:染色時(shí)間長(甚至達(dá) 18 小時(shí))不會影響 PSA 結(jié)果。 3. 4℃下染色 1 小時(shí)以上。 PSAFITC 染色 1.將 10 ml PSAFITC 工作液倒入一個(gè)垂直的染色缸。 5. 95% (v/v) 乙醇固定 30 分鐘。 3.確保精子均衡分布在載玻片上,無聚集。l 精子懸液的精子涂片。 4.輕輕混勻精子沉淀物 與剩余的上清液。 3.棄上清液,僅保留 2040181。 制備純化的精子 1.將上游或密度梯度洗滌過的精子制備液加入 10 ml 鹽水中。 5.輕輕混勻精子沉淀物與剩余的上清液。 4.棄上清液,僅保留 2040181。 2.加入 10 ml % (9 g/l) 鹽水。 6. PSA 工作液: ml PSA 原 液加入 10 ml PBS, 4℃儲存,溶液至少需穩(wěn)定 4 周。 4. 95% (v/v)乙醇。 2. pH 的磷酸鹽緩沖液( PBS)。這樣,應(yīng)根據(jù)精液標(biāo)本的質(zhì)量,選擇上游或密度梯度方法洗滌精液標(biāo)本。改良的方法更簡單,更具重復(fù)性,并且能得到非常清晰的影像(圖 )。 頂體狀態(tài)的熒光評價(jià)方法 這個(gè)方法最初是由 Cross et al. (1986)提出的,其后由 Liu amp。 Cooper amp。頂體反應(yīng)后的頂體狀態(tài)可通過顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢 測 (Fenichel et al., 1989。其它刺激物如鈣離子載體可誘發(fā)頂體反應(yīng),但是結(jié)果不如由透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng) (Liu amp。 Liu et al., 1991b。這些試驗(yàn)受限于有限的人卵透明帶。另一些患者可能顯示精子與透明帶正常結(jié)合,但透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng)差。 Franken et al., 2020)。由透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng)能通過從透明帶表面去除的精子或人透明帶分解的蛋白來評價(jià) (Liu amp。 Baker, 1992a, 2020).很少或沒有精子結(jié)合在透明帶上,通常提示精子有缺陷。 (Franken et al., 1989。 (Liu amp。計(jì)算結(jié)合在同一個(gè)透明帶上的檢測精子和對照精子數(shù),并求出比值。 Liu et al., 2020). 人卵透明帶結(jié)合試驗(yàn) 一種稱作半卵透明帶測定法的透明帶結(jié)合試驗(yàn) (Burkman et al., 1988)是將透明帶顯微切割成對等的兩半,每一半分別與相同濃度的檢查精子和對照精子進(jìn)行反應(yīng)。 Liu amp。 (Yanagimachi et al., 1979。為了檢測這一過程,需要使用來源于尸檢、外科卵巢切除術(shù)或體外授精得到的人卵母細(xì)胞。 (b) 如果沒有白細(xì)胞污染, FMLP反應(yīng)則消失,而 PMA引發(fā)一個(gè)顯著的由精子產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(也見于 Krausz et al., 1992)。 圖 細(xì)胞懸液產(chǎn)生活性氧能力與白細(xì)胞和精子亞群的關(guān)系 (a) 在存在白細(xì)胞污染的情況下,加如白細(xì)胞特異探針 FMLP 后,產(chǎn)生一個(gè) ROS 峰。l 的 10181。 2.等待至 FMLP 或調(diào)理的酵母多糖的信號消退。 圖 調(diào)理的酵母多糖產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光 白細(xì)胞濃度與產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號之間存在對數(shù)線性相關(guān) PMA 誘導(dǎo)白細(xì)胞和精子產(chǎn)生 ROS 試驗(yàn) 1.用 DMSO 以 1: 100 的比例將 PMA 原液稀釋成 10181。l 調(diào)理的酵母多糖至上述標(biāo)本,以刺激存在于精子懸液內(nèi)每個(gè)白細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。l 10 mmol/l FMLP 至上述標(biāo)本,以刺激存在于精子懸液內(nèi)每個(gè)白細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(見圖 )。 通過添加 FMLP、酵母多糖或 PMA 刺激精液白細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS,而 PMA 也可刺激精子產(chǎn)生ROS。l 辣根過氧化物酶( 1550 IU/ml)液。l 25 mmol/l 魯米諾。l 洗滌的精子懸液加入無酚紅的 KRM 混懸,后加入一個(gè)一次性照度計(jì)容器中,小心操作,避免產(chǎn)生氣泡。 2.用 KRM 洗滌精子(見 小節(jié)),調(diào)整精子密度為 10 106/ml。 1 20℃儲存?zhèn)溆谩? 1再次洗滌。 500g 離心 5 分鐘。 將沉淀物加入 5 ml 新鮮人血清輕吸制成懸液。 10 ml HBSS 洗滌沉淀物。 在燒杯里煮沸 20 分鐘,蓋蓋防止蒸 發(fā)。 酵母多糖的調(diào)理 500 mg 酵母多糖加入 10ml HBSS 制成懸液。 6. Phorbol 12myristate 13acetate( PMA), 1 mmol/l 原液: mg PMA 溶于 10 ml
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