【正文】 l 的懸浮液以避免精子 沉降。 ? 重新將精液樣本混勻，按以上步驟重復(fù)另一份稀釋。 ? 將移液管尖端的精液擦拭干凈，小心以避免碰到尖端的開口。 ? 將精液樣本混勻（ 請參閱 框 ） 。 ? 將蓋玻片緊壓支持柱以固定于計數(shù)池上，可通過觀察兩層玻璃之間的虹彩（多 重 Newton 環(huán)）來確認蓋玻片是否正確置放：光線越多，位置越 合適；如只有 12 條光線則提示計數(shù)池深淺不一。 106/ml)，建議對改良紐鮑爾氏計數(shù)池板的 9 個大方網(wǎng)格全部計數(shù)（ 請參閱 ），或使用 37 大容量的一次性計數(shù)板進行熒光檢測（請參閱 ）。 注釋 2： 為準確評估低密度精子（ 每179。 400 高倍視野 4：大約 1179。 注 4： 如果 1 + 19 (1: 20) 稀釋不合適，則使用 1 + 49 (1: 50)稀釋。 注 3： 如在推薦的稀釋倍數(shù)下每視野可見的精子數(shù)目太少，則以更低的稀釋倍數(shù)制備另一個濕片。 200視野的精子數(shù) 所需稀釋度 所需 精液量 （ μ l） 所需 固定液 （ μ l） 使用的 計數(shù)板 評估 區(qū)域 101 404 1： 20（ 1+19） 50 950 改良紐鮑氏 方格 6 16100 64400 1： 5(1+4) 50 200 改良紐鮑氏 改良紐鮑氏 215 860 1:2(1+1) 50 50 改良紐鮑氏 改良紐鮑氏 2 8 1:2(1+1) 50 50 改良紐鮑氏或更大容積 整塊玻片的9個方格 注 1： 白細胞移液管和依靠空氣置換原理的自動移液管并不足以將粘性精液準確稀釋 ，建議使用正向置換型移液管。 表 精液所需稀釋度、配制方法、使用的計數(shù)板和評估區(qū)域 每 179。 10目鏡，則 顯微鏡視野 的直徑大約是1000μ m(20 mm/20)。 如使用179。 10目鏡，則 顯微鏡視野 的直徑大約 500μ m(20 mm/40)。 如使用179。 框 池深為 20μ m的 濕片中每高倍視野的容積 36 每個顯微鏡檢測視野包含的精液量取決于該區(qū)域的面積（π r2，其中π大約是 ， r為顯微鏡檢測視野的半徑）和池的深度（濕片制備中大約是 m）。 ? 如果 檢測不到精子， 則檢測另一濕片。 400）的容 積（請參閱 框 ）。 ? 每高倍視野大約相當(dāng)于 16 nl (在 179。 200或179。 確定所需的稀釋度 如果要準確測量未稀釋精液樣本的精子數(shù)量，將精液予以稀釋是必要的，這種方法也通常用于在濕片制備中評測精子活力（請參閱 ）。 注： 由于計數(shù)的精子數(shù)目太少和計算的容積可能不太準確，上述濃度計算只是粗略的估計。建議以 1 + 1 (1: 2)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個大方格精子數(shù)量是 125。以 1 + 4 (1: 5)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個大方格精子數(shù)量為 500，這樣可獲得足夠低的抽樣誤差。 在初始的濕片制備中，如果容積為 4 nl 的 每 高倍視野（參閱 ）有 100 條精子，理論上精子密度為 25/ nl (25 000/μl 或 25 000 000 /ml)。 （廣西南寧第二醫(yī)院 生殖中心 劉峰） 35 常規(guī)計數(shù)程序 如果在計數(shù)池 5 和 6 大方格或是其中之一中有大約 200 條精子，那么按1 + 4 (1： 5) 和 1 + 19 (1： 20） 稀釋是合適的（見表 和 框 ）。 注釋 2： 當(dāng)精液量少以及用于計數(shù)的精子少于推薦量時，所獲得的數(shù)據(jù)的精確度將顯著下降。 34 表 參照精子計數(shù)總數(shù)的圓形樣本誤差（ %） 注釋 1： 太少的精子用于計數(shù)，將會得出不可確信的結(jié)果（見附錄 7， 節(jié)），對診斷和治療產(chǎn)生影響 (見附錄 7, )。詳見表 注意： 這些評估僅是大致，因為評估時可信度的間隔不會總是均勻。 樣本誤差一般表達為計數(shù)的百分比（ 100179。如果計數(shù) 400 個精子，則 SE 為 20（√ 400），其 95%CI 為 360440（ 400177。如果計數(shù) 200 個精子，則 SE 為 14（√ 200），其 95%CI 為 172288（ 200177。 如果計數(shù) 100 個精子，那么標準誤差（ SE）即為 10（√ 100），其 95%的置信區(qū)間（ CI）是 80120（ 100177。 2179。 179。 框 估計數(shù)值時的誤差 精子數(shù)目的估算精度依賴于所計數(shù)精子的數(shù)目。若溶液中是以結(jié)晶形式存在，使用前用 。 3． 4176。 圖 網(wǎng)格方格內(nèi)計數(shù)的精子 稀釋后精液的固定 1． 1000mL 純水中溶解 50g NaHCO3和 10 ml 35% (v/v)甲醛溶液。除頭部在兩條內(nèi)線之 33 間（白圈）的精子之外，方格中央的所有精子均計數(shù)，但頭部在兩條外線之間的需計數(shù)（黑圈）。 在消毒劑中過夜浸泡可重復(fù)使用的數(shù)精池和蓋玻片 (見附件 2, 部分 )，避免污染精液中潛在的 傳染因子 。摩搓網(wǎng)格方格可除去先前樣本的任何殘留物。 178。若有需要，其濃度應(yīng)通過與正常精子計數(shù)同樣的方法進行評估 (見 )，或其在精子中的比率可由染色法確定 (見 )。例如，精子大部分的頭部低于 L 型 (見圖 , 中間面板 )中央界線或在其左邊的，可計數(shù)，而中央界線上方或右邊的不予計數(shù)（見圖 , 右邊面板）。 178。 178。 血球細胞計數(shù)器網(wǎng) 格的使用 178。這些網(wǎng)格見圖 中數(shù)字所示。 改良的 Neubauer（紐鮑爾氏）血球細胞計數(shù)器 改良的 Neubauer 血細胞計數(shù)器有兩個隔開的計數(shù)池，每個計數(shù)池均在玻片上gridlines 蝕刻出顯微鏡下可見的 3 mm 3 mm 模式，采用專用的厚載玻片 (厚度 4 32 號 , mm)，由 mm 玻璃柱支撐，覆蓋網(wǎng)格。這種可選擇的計數(shù)池，其有效性須經(jīng)計數(shù)池核查量綱來確定 (見附錄 7, 節(jié) )，將 Neubauer 改良的血細胞計數(shù)器法得出的結(jié)果加以比較，獲得如客觀的質(zhì)量控制程序所顯 示出的滿意操作性能。rndahl amp。通過毛細管作用填充的淺計數(shù)池，由于流動精子不會均勻分布 (DouglasHamilton 等 , 2020a, 2020b)。 Mahmoud 等 , 1997。使用另外深度的血細胞計數(shù)器計數(shù)池，有著不同的深度和網(wǎng)格模式，要求不同的計數(shù)因子。 計算每次射精的精子總數(shù) 。 計算每 ml 精子密度。如是，則繼續(xù)計算；如否，則準備新的稀釋。 178。 178。 178。 178。 178。 在載玻片上涂抹液化后未稀釋的混勻精液樣本，覆上蓋玻片進行檢驗，以確定適于使用的稀釋度和計數(shù)池（見 ）。 注釋 3： 當(dāng)精子密度（每單位體積的數(shù)）有意義時，“精子密度（每單位體積的量）”一詞不應(yīng)使用?！熬涌倲?shù)”指的是一次射精時全部精液中的精子總數(shù)，由精子密度乘以精液體積獲得。 注釋 1： “精子總數(shù)”一詞與“精子密度”一詞并非同義詞。 Wang, 1979)及男 性生殖道通暢的指標 。 Andersen 等 , 2020。對于正常射精，當(dāng)男性生殖道是通暢的且禁欲時間短，每次射精時的精子總數(shù)均與睪丸容積有關(guān)(Handelsman 等 , 1984。此推論已為生殖率與精子總數(shù)之間關(guān)系的諸多資料所證明。 Zinaman et al., 2020)有關(guān)，可通過其預(yù)測受孕 (Bonde et al., 1998。細胞膜完整的精子數(shù)目可通過一次射精的總精子數(shù)乘以細胞膜完整精子的百分率來獲得?；钚跃樱毎ね暾樱┍壤膮⒖枷孪逓?58%（置信度為 95%，置信區(qū)間為 5563）。 圖 低滲膨脹狀態(tài)下的人類精子的典型形態(tài)變化表現(xiàn)示意圖 （ a）無變化 （ b） — （ g）不 同的尾部變化 灰色區(qū)域提示為腫脹的尾部。 30 計分 ，如顯示為尾部卷縮（圖 ）。如果差異過高，則重新制備標本再次進行評估（見框 ）。 11. 以表 或是圖 ，附錄 7 為標準（在僅考慮樣本誤差的前提下，均顯示 95%的樣本 其兩個百分率的最大差異是可以接受的），推斷是否為可接受的差異。 9. 為了保證較低的樣本誤差，每張涂片計數(shù) 200 個精子（見框 ）。 7. 用放大倍數(shù)為 200 或 400 倍的光學(xué)顯微鏡檢測涂片。 22mm的蓋玻片。用移液器緩慢抽吸混勻。 （見框 ）。 操作步驟 1. 使用前溶解膨脹液 充分混勻。該溶液需保存于 20℃的環(huán)境中。如為常規(guī)診斷用途可孵化 30分鐘 178。細胞膜完整的精子在低滲介質(zhì)中會于 5 分鐘膨脹，且其形狀會在 30 分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定 (Hossain 等 , 1998)。 29 活精子的低滲膨脹檢驗 作為一種可供選擇的染色排除方法，低滲膨脹（ HOS）檢驗可以用于評估精子的存活情況（ Jeyendran 等， 1984）。 正常參考下限 活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為 58%（置信度為 95%，置信區(qū)間為 5563）。 2. 如果染色僅限于頸部區(qū)域，剩余的頭部未染色，則可認為是“頸部細胞膜不全”，這并非是細胞死亡和細胞膜崩解的標志，此類細胞應(yīng)被認為是存活細胞。 11. 所報告的精子活力的百分比應(yīng)盡可 能涵蓋所有的精子數(shù)目。 10．如果其百分率上的差異是可以接受的，則可報告其活力的平均百分比。 8. 統(tǒng)計所制備的兩張玻片中活動精子的平均數(shù)和百分率的差異。 6. 用實驗 室計數(shù)器來計數(shù)染色（死亡）和非染色（存活）細胞的數(shù)目。 4. 重新混勻精液樣本，重新吸取樣本，重復(fù)上述步驟 2 和 3。 3. 用 22mm179。 2. 吸取 5μl 的精液樣本，同 5μl 的曙紅溶液在載玻片上混勻。如果使用這種溶液，需向 100ml 溶液中添加 的 NaCl 以提高滲透壓。 2 .曙紅 Y 染劑， %（ w/v）：將 曙紅 Y（比色指數(shù)， 45380）染料溶于100ml 濃度為 %的 NaCl 溶液中。 僅用曙紅（伊紅）染料評估精子活力 該方法簡單快速，但所制備濕片無法儲存以用于質(zhì)量控制。 正常參考下限 活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為 58%（置信度為 95%，置信區(qū)間為 5563） 。 3. 如果精子頭部僅有小部分被染色，認為是頸膜泄漏，不是細胞死亡和全部膜破壞的跡象。 27 計數(shù) 1. 苯胺黑使整個標本的背景成為黑色，因此容易分辨被染色的與未被染色的精子。 12. 用四舍五入法記錄所得的比例值。 10. 對照表 （在某一均值下，兩個比例差距可接受的最大值）以確定差值是否可以接受。 8. 為了避免樣本錯誤，每個標本至少要數(shù) 200 個精子。 6. 用 100 倍的油浸物鏡觀察。 4. 將兩份樣本的懸浮液分別涂抹在不同的載波片上（見 節(jié)），然后置于空氣中風(fēng)干。 2. 將 1/5 的精液與 5μl 伊紅溶液混合，置于顯微鏡載玻片上，用移液管混勻，在載玻片上均勻展開。 （如 90g/m2）濾掉渣滓及凝膠狀沉淀物，然后存儲于黑色密封的玻璃瓶 內(nèi)。 — 苯胺黑：將 10 克 苯胺黑加 到配好的 100 毫升的曙紅 Y 試劑中。將染色后的精液制成標本放到顯微鏡下觀察。 注 2： 若出現(xiàn)完全不動且為活性精子的比例較大的情況，則提示精子鞭毛存在結(jié)構(gòu)性缺陷；若完全不動且為死亡精子比例較大則提示附睪 存在病理。防止時間過長，因脫水及溫度的變化對評估結(jié)果產(chǎn)生的負面影響。下面將會對這兩種方法分別舉例。 活精子的比例通過評估精子細胞膜的完整程度來完成，而細胞膜的完整程度評估運用染色排除法或低滲透腫脹法。尤其當(dāng)積極活躍型精子比例小于 40%時，評估精子活性就非常必要。 注： 一次射精的精液中的運動活躍型精子總數(shù)具有生 理上的意義，它的值等于精液中的總精子數(shù)乘以運動活躍型精子的比例。 觀察值小于 10%（ 66%30%），因此，接受該觀察值，并記錄如下：運動型精子占 32%，非運動型精子占 4%，完全不動型精子占 63%。 例 2：某兩份精液標本（每個標本的精子數(shù)均大于 200）的精子能動性分析 25 如下：運動活躍型精子分別占 37%和 28%；非運動活躍型精子分別占 5%和 6%；完全不動型精子分別占 60%和 66%，占比例最大的為完全不動型，它們的均值為 63%。對照表 ，在均值為 50%的情況下，差值大于 10%， 認為僅是偶然發(fā)生事件。 示例 例 1：某兩份精液標本（每個標本的精子 運動活躍型精子分別占 5%和 15%；完全不動型精子分別占 65%和 35%。 當(dāng)差