【正文】 注釋 2： 如果患者無法提供精液樣本，性交后試驗（見 ）可能會提供其精子情況的相關(guān)信息。 液化 精液射入容器后立即形成典型的半透明凝塊，室溫下在數(shù)分鐘內(nèi)，精液通常開始液化（變?。?，此時可以看到不均勻的凝塊在液體中。 粘液絲的出現(xiàn)可能干擾精液 14 分析。 注 2： 在液化過程中，持續(xù)輕柔的混勻或旋轉(zhuǎn)樣本容器可以降低精液密度測定過程中的誤差。 1． 加入等量的培養(yǎng)液 (如杜氏磷酸鹽緩沖液 , 詳見附錄 4， )，然后重復(fù)用加樣器吹打也可以使某些樣本液化。 注釋： 這些處理可能會影響到精漿的生化性質(zhì)，精子活力以及精子外形，如有使用必須記錄。 注釋： 高粘稠度會干擾對就精子活力、密度的判定以及對覆蓋在精子表面的抗體和生化標志物的檢測 。 精液體積 精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睪分泌物構(gòu)成，體積的精確測 量對評估精液非常重要，他影響精液中精子總數(shù)和非精子細胞數(shù)的計算。 Cooper 等 , 2020))。 此外，可以直接測量精液體積 。該法導(dǎo)致的體積損失量在 （ Brazil 等， 2020a； Iwamoto等， 2020； Cooper 等 , 2020）。 von Eckardstein 等 , 2020)的特征。 16 參考值下限 精液體積的參考值下限為 ml（ 95%置信區(qū)間（ CI）， ）。 將一滴精液在 pH試紙上均勻展開。對于粘稠的樣本，可取小份樣本用專為測量粘稠溶液設(shè)計的 pH量尺進行檢測。 Weiske 等 , 2020。 注釋 2： 精液的 pH值 如 隨時間推移而升高，可能是由于自然緩沖物減少，所以高pH值不能提供有價值的臨 床信息。 17 充分混勻精液和取樣 充分均勻液化的精液本身就有利于解決化驗取樣是誤差的問題，如樣本不夠均勻，觀察同一 份精液制備兩份標本有關(guān)精子活動、活力、密度及形態(tài)等結(jié)果時可能出現(xiàn)明顯偏差，為了給生育力的評估提供可靠資料，在檢測前，精液樣本必須充分混勻 (見框 )，兩等份的數(shù)值必須相符才可接受測量結(jié)果。 濕片的制作 充分混勻精液樣本（見框 )； 混勻后立即取樣，以免精子在懸液中沉淀； 再次取樣前還需進行混勻，進行分析檢查時精液體積和蓋玻片的尺寸必須標準化，以保持精子在固定厚度約 20181。m厚度，蓋玻片的重量使標本均勻展開； 應(yīng)注意避免在蓋玻片和載玻片之間產(chǎn)生氣泡； 對新制成的濕片，等到玻片上界面不再晃動時應(yīng)盡快進行檢測。如，體積為 10181。l 的樣本上加蓋一張 21mm179。m會限制精子的旋轉(zhuǎn)運動 (Le Lannou 等 , 1992。 注 4： 欠缺代表性也可能會導(dǎo)致粘稠度和液化的異常（見 ），精子的聚集（見 ）或 精子的凝集（見 ）。 劇烈震蕩會使精子活力過度表現(xiàn)，但有時由于凝集會限制精子的活動力。又可分根據(jù)程度又可分 a b c d。 注釋 2： 嚴重的精子凝集能夠影響對精子活力和密度的評估?？梢酝ㄟ^過 氧化物酶技術(shù)和全白細胞單克隆抗原技術(shù)來進行鑒別。防止時間過長，因脫水、 pH 值及溫度的變化對評估結(jié)果產(chǎn)生的負面影響。 拌勻后立即（防止精子沉淀）取出一等份。 將上面的兩份樣本分別滴大約 20181。 178。 178。（見 節(jié)）。 非運動活躍型 (NP)：精子運動但不活躍，如精子在 較小的范圍內(nèi)運動，精子頭部輕微移位或盡有鞭毛擺動。 注 2： 當(dāng)討論精子活動率時，細分精子的總能動性（ PR+NP）和活躍精子能動性（ PR）非常重要。 根據(jù)經(jīng) 驗，也可以同時計數(shù)一個網(wǎng)格內(nèi)的三種類型的精子然后再數(shù)另一網(wǎng)格內(nèi) 的三種類型的精子，直到將所選區(qū)域數(shù)完。 每個標本至少在 5 個不同的區(qū)域計數(shù)，所數(shù)的精子總數(shù)應(yīng)該不低于 200 個 23 以避免小樣本錯誤。 將計算的結(jié)果對照表 （在 95%的置信區(qū)間內(nèi)，在某一均值下，兩個比例差 距 可接受的最大值）。 通過四舍五入 記錄 PR、 NP 和 IM 比例均值的整數(shù)值。 圖 目鏡標線對活性精子計數(shù)很有幫助（圖 a），系統(tǒng)性地選擇計數(shù)區(qū)域，計數(shù)范圍應(yīng)該至少距蓋玻片 5μm（圖 b）。 對照表 ，若兩個標本 PR、 NP、 IM 比例的差值剛好等于可接受的最大差值，則接受該值。 示例 例 1：某兩份精液標本（每個標本的精子 運動活躍型精子分別占 5%和 15%；完全不動型精子分別占 65%和 35%。 例 2：某兩份精液標本（每個標本的精子數(shù)均大于 200）的精子能動性分析 25 如下：運動活躍型精子分別占 37%和 28%；非運動活躍型精子分別占 5%和 6%；完全不動型精子分別占 60%和 66%，占比例最大的為完全不動型，它們的均值為 63%。 注： 一次射精的精液中的運動活躍型精子總數(shù)具有生 理上的意義，它的值等于精液中的總精子數(shù)乘以運動活躍型精子的比例。 活精子的比例通過評估精子細胞膜的完整程度來完成，而細胞膜的完整程度評估運用染色排除法或低滲透腫脹法。防止時間過長，因脫水及溫度的變化對評估結(jié)果產(chǎn)生的負面影響。將染色后的精液制成標本放到顯微鏡下觀察。 （如 90g/m2）濾掉渣滓及凝膠狀沉淀物，然后存儲于黑色密封的玻璃瓶 內(nèi)。 4. 將兩份樣本的懸浮液分別涂抹在不同的載波片上（見 節(jié)），然后置于空氣中風(fēng)干。 8. 為了避免樣本錯誤，每個標本至少要數(shù) 200 個精子。 12. 用四舍五入法記錄所得的比例值。 3. 如果精子頭部僅有小部分被染色，認為是頸膜泄漏，不是細胞死亡和全部膜破壞的跡象。 僅用曙紅（伊紅）染料評估精子活力 該方法簡單快速，但所制備濕片無法儲存以用于質(zhì)量控制。如果使用這種溶液，需向 100ml 溶液中添加 的 NaCl 以提高滲透壓。 3. 用 22mm179。 6. 用實驗 室計數(shù)器來計數(shù)染色（死亡）和非染色（存活）細胞的數(shù)目。 10．如果其百分率上的差異是可以接受的，則可報告其活力的平均百分比。 2. 如果染色僅限于頸部區(qū)域，剩余的頭部未染色，則可認為是“頸部細胞膜不全”，這并非是細胞死亡和細胞膜崩解的標志，此類細胞應(yīng)被認為是存活細胞。 29 活精子的低滲膨脹檢驗 作為一種可供選擇的染色排除方法，低滲膨脹（ HOS）檢驗可以用于評估精子的存活情況（ Jeyendran 等， 1984）。如為常規(guī)診斷用途可孵化 30分鐘 178。 操作步驟 1. 使用前溶解膨脹液 充分混勻。用移液器緩慢抽吸混勻。 7. 用放大倍數(shù)為 200 或 400 倍的光學(xué)顯微鏡檢測涂片。 11. 以表 或是圖 ，附錄 7 為標準（在僅考慮樣本誤差的前提下，均顯示 95%的樣本 其兩個百分率的最大差異是可以接受的），推斷是否為可接受的差異。 30 計分 ，如顯示為尾部卷縮（圖 ）。活性精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為 58%（置信度為 95%，置信區(qū)間為 5563）。 Zinaman et al., 2020)有關(guān)，可通過其預(yù)測受孕 (Bonde et al., 1998。對于正常射精，當(dāng)男性生殖道是通暢的且禁欲時間短，每次射精時的精子總數(shù)均與睪丸容積有關(guān)(Handelsman 等 , 1984。 Wang, 1979)及男 性生殖道通暢的指標 ?！熬涌倲?shù)”指的是一次射精時全部精液中的精子總數(shù)，由精子密度乘以精液體積獲得。 在載玻片上涂抹液化后未稀釋的混勻精液樣本，覆上蓋玻片進行檢驗，以確定適于使用的稀釋度和計數(shù)池（見 ）。 178。 178。如是，則繼續(xù)計算；如否，則準備新的稀釋。 計算每次射精的精子總數(shù) 。 Mahmoud 等 , 1997。rndahl amp。 改良的 Neubauer（紐鮑爾氏）血球細胞計數(shù)器 改良的 Neubauer 血細胞計數(shù)器有兩個隔開的計數(shù)池，每個計數(shù)池均在玻片上gridlines 蝕刻出顯微鏡下可見的 3 mm 3 mm 模式，采用專用的厚載玻片 (厚度 4 32 號 , mm)，由 mm 玻璃柱支撐，覆蓋網(wǎng)格。 血球細胞計數(shù)器網(wǎng) 格的使用 178。 178。若有需要，其濃度應(yīng)通過與正常精子計數(shù)同樣的方法進行評估 (見 )，或其在精子中的比率可由染色法確定 (見 )。摩搓網(wǎng)格方格可除去先前樣本的任何殘留物。除頭部在兩條內(nèi)線之 33 間（白圈）的精子之外，方格中央的所有精子均計數(shù)，但頭部在兩條外線之間的需計數(shù)（黑圈）。 3． 4176。 框 估計數(shù)值時的誤差 精子數(shù)目的估算精度依賴于所計數(shù)精子的數(shù)目。 2179。如果計數(shù) 200 個精子，則 SE 為 14（√ 200），其 95%CI 為 172288（ 200177。 樣本誤差一般表達為計數(shù)的百分比（ 100179。 34 表 參照精子計數(shù)總數(shù)的圓形樣本誤差（ %） 注釋 1： 太少的精子用于計數(shù)，將會得出不可確信的結(jié)果（見附錄 7， 節(jié)），對診斷和治療產(chǎn)生影響 (見附錄 7, )。 （廣西南寧第二醫(yī)院 生殖中心 劉峰） 35 常規(guī)計數(shù)程序 如果在計數(shù)池 5 和 6 大方格或是其中之一中有大約 200 條精子，那么按1 + 4 (1： 5) 和 1 + 19 (1： 20） 稀釋是合適的（見表 和 框 ）。以 1 + 4 (1: 5)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個大方格精子數(shù)量為 500，這樣可獲得足夠低的抽樣誤差。 注： 由于計數(shù)的精子數(shù)目太少和計算的容積可能不太準確，上述濃度計算只是粗略的估計。 200或179。 400）的容 積（請參閱 框 ）。 框 池深為 20μ m的 濕片中每高倍視野的容積 36 每個顯微鏡檢測視野包含的精液量取決于該區(qū)域的面積（π r2，其中π大約是 ， r為顯微鏡檢測視野的半徑）和池的深度（濕片制備中大約是 m）。 10目鏡，則 顯微鏡視野 的直徑大約 500μ m(20 mm/40)。 10目鏡，則 顯微鏡視野 的直徑大約是1000μ m(20 mm/20)。 200視野的精子數(shù) 所需稀釋度 所需 精液量 （ μ l） 所需 固定液 （ μ l） 使用的 計數(shù)板 評估 區(qū)域 101 404 1： 20（ 1+19） 50 950 改良紐鮑氏 方格 6 16100 64400 1： 5(1+4) 50 200 改良紐鮑氏 改良紐鮑氏 215 860 1:2(1+1) 50 50 改良紐鮑氏 改良紐鮑氏 2 8 1:2(1+1) 50 50 改良紐鮑氏或更大容積 整塊玻片的9個方格 注 1： 白細胞移液管和依靠空氣置換原理的自動移液管并不足以將粘性精液準確稀釋 ，建議使用正向置換型移液管。 注 4： 如果 1 + 19 (1: 20) 稀釋不合適，則使用 1 + 49 (1: 50)稀釋。 注釋 2： 為準確評估低密度精子（ 每179。 ? 將蓋玻片緊壓支持柱以固定于計數(shù)池上，可通過觀察兩層玻璃之間的虹彩（多 重 Newton 環(huán)）來確認蓋玻片是否正確置放：光線越多，位置越 合適；如只有 12 條光線則提示計數(shù)池深淺不一。 ? 將移液管尖端的精液擦拭干凈，小心以避免碰到尖端的開口。l 的懸浮液以避免精子 沉降。 ? 重新將精液樣本混勻，按以上步驟重復(fù)另一份稀釋。 ? 將精液樣本混勻（ 請參閱 框 ） 。 106/ml)，建議對改良紐鮑爾氏計數(shù)池板的 9 個大方網(wǎng)格全部計數(shù)（ 請參閱 ），或使用 37 大容量的一次性計數(shù)板進行熒光檢測（請參閱 ）。 400 高倍視野 4：大約 1179。 注 3： 如在推薦的稀釋倍數(shù)下每視野可見的精子數(shù)目太少，則以更低的稀釋倍數(shù)制備另一個濕片。 表 精液所需稀釋度、配制方法、使用的計數(shù)板和評估區(qū)域 每 179。 如使用179。 如使用179。 ? 如果 檢測不到精子， 則檢測另一濕片。 ? 每高倍視野大約相當(dāng)于 16 nl (在 179。 確定所需的稀釋度 如果要準確測量未稀釋精液樣本的精子數(shù)量，將精液予以稀釋是必要的，這種方法也通常用于在濕片制備中評測精子活力（請參閱 ）。建議以 1 + 1 (1: 2)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個大方格精子數(shù)量是 125。 在初始的濕片制備中，如果容積為 4 nl 的 每 高倍視野（參閱 ）有 100 條精子，理論上精子密度為 25/ nl (25 000/μl 或 25 000 000 /ml)。 注釋 2： 當(dāng)精液量少以及用于計數(shù)的精子少于推薦量時，所獲得的數(shù)據(jù)的精確度將顯著下降。詳見表 注意：