【正文】 復(fù)習(xí)思考題 1. Stringent plasmid、 Relaxed plasmid、 segregation instability、 broad host range plasmid 2. 質(zhì)粒復(fù)制的方式及其復(fù)制起點(diǎn) (ori)區(qū)的功能？ 3. 什么是質(zhì)粒的不相容性？產(chǎn)生原因？ 4. 質(zhì)粒主動(dòng)分配的機(jī)理？ 5. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移性？可移動(dòng)質(zhì)粒的特點(diǎn)？ 6. 何謂自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒？在 G細(xì)菌中，自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒有何特征？ 7. tra基因和 oriT在質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用？ 8. 繪圖說(shuō)明 F質(zhì)粒誘動(dòng) ColE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的原理？ 9. 廣寄主范圍質(zhì)粒的構(gòu)建？ 10. ColE1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制？ 11. 檢測(cè)質(zhì)粒的方法主要根據(jù)什么？ 12. 質(zhì)粒的遺傳表型有哪些？ 。 8． 共生固氮質(zhì)粒 ：存在于不同根瘤菌中，并能與相應(yīng)的豆科植物進(jìn)行共生固氮的一類(lèi)質(zhì)粒。目前研究較多且應(yīng)用廣泛的蘇云金芽孢桿菌的毒素蛋白基因大多定位在質(zhì)粒上。 降解性質(zhì)粒一般也有接合能力和大的分子量。 5． 降解質(zhì)粒 ：這一類(lèi)質(zhì)粒編碼的降解酶能降解一些特殊的有機(jī)物，從而使宿主菌能利用許多不容易為一般細(xì)菌分解的物質(zhì)作為碳源和能源生長(zhǎng)。 ?細(xì)菌素能與敏感菌細(xì)胞壁上的專(zhuān)一性受體蛋白結(jié)合，進(jìn)而抑制或殺死敏感細(xì)菌；細(xì)菌素產(chǎn)生菌株因含有免疫基因（ imm）而不受其產(chǎn)物的危害。 3． 產(chǎn)生抗生素的質(zhì)粒和產(chǎn)生細(xì)菌素的質(zhì)粒 ?抗生素和細(xì)菌素都屬于抗菌物質(zhì)，很多放線(xiàn)菌能產(chǎn)生抗生素，如 SCP1質(zhì)粒是能使宿主產(chǎn)生抗生素的典型代表，與次甲霉素 A合成有關(guān)的基因都位于這個(gè)巨型的線(xiàn)性質(zhì)粒上。 2． 抗性質(zhì)粒（ R） ：能使宿主對(duì)抗生素、化學(xué)藥物、重金屬等殺菌劑表現(xiàn)出抗性的一大類(lèi)質(zhì)粒的統(tǒng)稱(chēng)。 1． 致育質(zhì)粒 ：具有促進(jìn)細(xì)胞結(jié)合的表型效應(yīng)。 ?電鏡觀(guān)察 五、質(zhì)粒編碼的遺傳表型 大多數(shù)質(zhì)粒均控制著宿主細(xì)胞的一種或幾種特殊性狀，即具有一定的表型。 質(zhì)粒的純化和檢測(cè)可用： ?瓊脂糖凝膠電泳 一般同一分子量、不同構(gòu)型的 DNA電泳速度是： cccDNAocDNA（缺刻環(huán)狀 DNA） L DNA （線(xiàn)性 DNA）。 四、質(zhì)粒的分離、檢測(cè)與純化 質(zhì)粒存在的直接證明取決于從宿主細(xì)胞中直接檢測(cè)、分離和純化質(zhì)粒 DNA。 二、遺傳轉(zhuǎn)移 自主轉(zhuǎn)移、誘動(dòng)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。 吖啶橙染料等是質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制抑制劑，大炭霉素、 SDS等是選擇性殺菌劑，它們對(duì)有性菌毛的菌產(chǎn)生作用。 影響質(zhì)粒消除的因素：消除劑、宿主狀態(tài)、消除條件等。 如何區(qū)別某一遺傳性狀的喪失是質(zhì)粒消除還是染色體基因突變的結(jié)果？ ?回復(fù)突變：質(zhì)粒消除不可逆，基因突變（缺失突變除外）可以經(jīng)回復(fù)突變而恢復(fù)原有性狀。根據(jù)這些特性可以容易地對(duì)宿主中的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)、分離和純化。根據(jù)這些遺傳學(xué)特性，可采用質(zhì)粒消除、遺傳轉(zhuǎn)移、分子雜交等初步檢測(cè)菌株中是否含有質(zhì)粒。 接合轉(zhuǎn)移時(shí)，先將可移動(dòng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入誘動(dòng)菌株，然后將該菌株與受體菌混合，從而誘動(dòng)可移動(dòng)質(zhì)粒向受體轉(zhuǎn)移， 而自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒本身并不轉(zhuǎn)移 。 三親雜交：將兩種質(zhì)粒分別導(dǎo)入不同的大腸桿菌細(xì)胞，再將含有不同質(zhì)粒的兩個(gè)菌株與受體菌混合培養(yǎng)。 2. 廣寄主范圍質(zhì)粒載體的接合轉(zhuǎn)移 1）分別含有 tra和 oriT的雙質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 利用廣寄主范圍質(zhì)粒載體和自主轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蚱溲苌|(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移，通過(guò)雙親雜交或三親雜交的方法進(jìn)行。 ?如果這些質(zhì)粒上帶有 RP4質(zhì)?；蚱渌|(zhì)粒的 mobsite，則能被 RP4質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移到不含質(zhì)粒的大腸桿菌或其他 G細(xì)菌中 。 八、 廣寄主范圍質(zhì)粒載體 ?一般把 RP4或 RK2質(zhì)粒中 DNA轉(zhuǎn)移位點(diǎn) ， 即 oriT DNA序列稱(chēng)為 mobsite。 ?從理論上講，可移動(dòng)質(zhì)粒只要含有與自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒相同的oriT位點(diǎn)就能被轉(zhuǎn)移。 ?oriT是質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn) ， 當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí) tra基因編碼的內(nèi)切酶在 oriT位點(diǎn)造成缺口 ， 質(zhì)粒的一條DNA開(kāi)始從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移 。 ?RK2和 RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移機(jī)制類(lèi)似于 F質(zhì)粒 ， 即接合轉(zhuǎn)移需要兩個(gè)功能區(qū)： oriT區(qū)和 tra區(qū) 。 ?這類(lèi)質(zhì)粒的大小為 60kb， 在大腸桿菌中的拷貝數(shù)為 47個(gè) ， oriV是質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)復(fù)制區(qū) ， 具有與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的 tra基因和 oriT位點(diǎn) ， 含有氨芐青霉素抗性 、 卡那霉素抗性及四環(huán)素抗性 。 ?大腸桿菌 IncP組包括很多種天然質(zhì)粒，大小在 6090kb，具有多種抗性基因，如：卡那霉素 (Kan)、四環(huán)素 (Tet)、氨芐青霉素 (Amp)、鏈霉素 (Str)、磺胺 (Sul)、汞離子(met)、氯霉素 (Cam)、慶大霉素 (Gen)、甲氧芐二氨嘧啶 (Tp)、環(huán)絲氨酸 (Ox)等。 ?有研究表明 IncP質(zhì)粒還能接合轉(zhuǎn)移到 G+細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞中 。 廣寄主范圍質(zhì)粒： 指質(zhì)粒能通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移到很多不同種甚至不同屬的寄主內(nèi) ， 并能穩(wěn)定地存在于這些寄主細(xì)胞內(nèi) 。但 F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移只限于親緣關(guān)系較近的腸桿菌 ， 其寄主范圍較窄 。 但它們含有與 F質(zhì)粒的 oriT類(lèi)似的 bom位點(diǎn)和可移動(dòng)基因mob(mobilization)， 因而能夠被帶有 tra基因的質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移 。ColEl的 bom位點(diǎn)類(lèi)似于 F質(zhì)粒的 oriT。 因此 ， 在進(jìn)行轉(zhuǎn)移時(shí) ， 必須利用位于同一細(xì)胞內(nèi)的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒編碼合成的性菌毛才能進(jìn)行 。 F質(zhì)粒的 oriT位點(diǎn)的序列小于 300bp，含有反向重復(fù)序列，并富含 AT堿基。 (2) oriT位點(diǎn)： oriT位點(diǎn)不僅是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn) ， 也是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移后 DNA末端再環(huán)化的位點(diǎn) ， 因此質(zhì)粒必須具有oriT位點(diǎn)才能進(jìn)行自主轉(zhuǎn)移 。 ?自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒能誘導(dǎo)含有與自己相同或相似的 oriT位點(diǎn)的非自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移，如將自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒整合到染色體上后，帶動(dòng)染色體轉(zhuǎn)移也是從質(zhì)粒的 oriT位點(diǎn)開(kāi)始的。 ?許多 G細(xì)菌中的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒需要大于 30kb的 DNA來(lái)編碼與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)，如 F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移操縱子 (tra)就包含 23個(gè)基因，大小為 33 kb。 ?G+細(xì)菌如鏈霉菌中的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ， 除 SCPl是巨大質(zhì)粒外 ， 很多都是 10kb左右的小質(zhì)粒 ， 而與轉(zhuǎn)移有關(guān)的區(qū)域只有 2kb左右 。 六、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 分為轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性?xún)纱箢?lèi)型 有些質(zhì)粒雖然不能自主轉(zhuǎn)移，但能被其他一些自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒所轉(zhuǎn)移，這類(lèi)質(zhì)粒又被叫做可移動(dòng)質(zhì)粒 (mobilizable plasmid)。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移性： 是指質(zhì)粒能自動(dòng)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞 ， 甚至還能帶動(dòng)供體細(xì)胞的染色體 DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移 ， 這類(lèi)質(zhì)粒常常被叫做自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 (selftransmissible plasmid)。 盡管在大腸桿菌培養(yǎng)物中出現(xiàn)無(wú) pBR322質(zhì)粒細(xì)胞的可能性較低 ， 但在一定的條件下 ， 如培養(yǎng)基耗盡或是寄主細(xì)胞快速生長(zhǎng)分裂的過(guò)程中 ， 仍有可能產(chǎn)生出無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞 。 另外， ColEl質(zhì)粒含有不依賴(lài)于 recA的 cer基因，負(fù)責(zé)多聚體的解聚作用，使之重新轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w質(zhì)粒以保證質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)的穩(wěn)定性。 (random distribution) ColEl等多數(shù)高拷貝質(zhì)粒一般沒(méi)有 par基因 ， 它們依賴(lài)于高拷貝質(zhì)粒的隨機(jī)分配來(lái)實(shí)現(xiàn)分裂過(guò)程中的穩(wěn)定性 。 隨機(jī)分配： 是指在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞之間是隨機(jī)分配的 。毒劑 CcdB和解毒劑 CcdA具有不同的穩(wěn)定性，是導(dǎo)致分裂后細(xì)胞致死的關(guān)鍵因素。 ?寄主致死體系（ hostkilling mechanism） ?在新產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒的子細(xì)胞中，開(kāi)始的時(shí)候是含有 CcdA和 CcdB這兩種蛋白質(zhì)的。 ?在含質(zhì)粒的細(xì)胞中 ， CcdA蛋白作為解毒劑專(zhuān)門(mén)與毒劑CcdB蛋白結(jié)合 ， 并使之失效 。 復(fù)制后的質(zhì)粒