質粒分子生物學與質粒技術(參考版)
2025-01-10 09:29本頁面
【正文】 圖 221 瞬時表達載體 pMSG 圖 222 制備等基因表達的 FlpInTM 寄主細胞系 (invitrogen 公司 ) 圖 223 制備 FlpInTM 表達細胞系 (invitrogen 公司 ) 。 哺乳動物細胞表達載體對克隆基因的要求： ① 一般使用 cDNA。 ⑤ 終止和加 poly(A)的信號序列 。 ③ 能進行染色體外復制的病毒復制子序列 。 哺乳動物細胞表達載體的功能元件： ① 原核細胞復制原點和篩選基因 (抗生素抗性 )。 哺乳動物細胞表達載體 載體的類型： ① 自主復制的瞬時表達載體：帶有真核病毒復制子。 圖 210 阿特拉津氯水解酶基因 atzA的定位 7 質粒測序和基因注釋 (annotation) 質粒測序：用鳥槍克隆法 ， 將純化的質粒用超聲波打碎 ， 用瓊脂糖凝膠電泳分離 1２ kb片段 ，補平片段末端 ， 與平末端 pUC18連接 ， 電轉化 E. coli DH5α， 篩選有插入片段的 轉化子 ， 測定克隆片段的序列 ， 根據(jù)測序結果拼接質粒序列 ， 空缺部分用 PCR方法補齊并測序 。 ② （ 重疊片段克隆法 ） 作圖策略： a. HindⅢ 、 EcoRⅠ 和 XbaⅠ 單酶消化：測定限制片段大小和切點數(shù) 。 直接酶切法是通過限制酶的完全消化和部分消化 ， 確定各種限制酶切割位點在質粒中的位置 ， 適用于小質粒；重疊片段克隆法是先進行限制片段的克隆 ， 確定每個克隆片段的限制酶位點 ， 以及各克隆片段在質粒中的排列順序 ， 最后得到整個質粒的限制圖 ，適合于較大的質粒 。 ③ 液體雜交：靜止培養(yǎng)供體菌和受體菌的混合物 ， 然后涂選擇平板 ， 篩選接合體 。 4 細菌雜交實驗 ① 濾膜雜交：混合供體和受體菌培養(yǎng)物 ， 用孔徑為 ， 帶菌的濾膜在營養(yǎng)平板上培養(yǎng)過夜 ， 用無菌水洗下膜上的細菌 ， 涂選擇平板 ， 篩選接合體 。 轉化頻率 （ transformation frequency） ：每個活細胞產生的轉化子數(shù) ， 測定時使用飽和 DNA濃度 。 MP 2 質粒的拷貝數(shù)測定（ 凝膠帶熒光光密度測定法） 3 質粒 DNA轉化 質粒轉化主要有 3種方法：鈣誘導的感受態(tài)轉化 ， 原生質體轉化 ， 電穿孔轉化 。 (染色體峰面積 + 質粒峰面積 ) ② 測定一個細胞中總 DNA的含量 (Mc = DNA的 g數(shù)／細胞數(shù) )。 ① 細胞裂解物進行瓊脂糖凝膠電泳 ， 熒光掃描染色體DNA帶和質粒 DNA帶 ， 根據(jù)峰面積計算質粒占總 DNA的百分數(shù) (RP)。 中華苜蓿根瘤菌（ Sinorhizobium meliloti）1021的基因組組成 性質 染色體 pSymA pSymB 基因組 長度 (bp) 3654135 1354226 1683333 6691694 蛋白基因 3341 1293 1570 6204 tRNA基因 51 2 1 54 rRNA操縱子 3 0 0 3 共生功能 菌毛合成 菌毛合成 表面多糖 結瘤，固氮 表面多糖 固氮 第 2講 質粒技術 1. 質粒的分離和純化 2. 質粒的拷貝數(shù)測定 3. 質粒 DNA轉化 4. 細菌雜交實驗 5. 質粒的限制酶作圖
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