【正文】 。使用厭氧培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧微生物分離培養(yǎng)時(shí)，整個(gè)操作過程可在正壓℃ O2或氮?dú)庀逻M(jìn)行，使整個(gè)接種過程在無(wú)氧狀態(tài)。培養(yǎng)箱的溫度能自行調(diào)節(jié)控制，氣路安排合理，能任意輸入所需氣體和準(zhǔn)確調(diào)節(jié)流量。 ? (4)厭氧罐培養(yǎng)法： ? 堿性焦性沒食子酸法：焦性沒食子酸與Na2℃ O3反應(yīng)可釋放出 ℃ O2并吸收環(huán)境中的氧 。 ? (3)液體培養(yǎng)基法：液體培養(yǎng)基法主要是在培養(yǎng)基中加入一定的還原物質(zhì)并隔絕空氣 。 ? (2)深層穿刺與化學(xué)吸氧相結(jié)合：深層穿刺后 ， 在培養(yǎng)基上部加一層非脫脂棉 ，再加一層脫脂棉 ， 上面加入焦性沒食子酸和 Na2℃ O3粉末的混合物 ， 用膠塞或塑料帽蓋緊 。 此時(shí)拔出橡皮塞 ， 用無(wú)菌刀切割 ， 分離再培養(yǎng) 。 穿刺接 |種或待分離物 。 ? 厭氧培養(yǎng)的方法 ? (1)深層穿刺分離培養(yǎng)：用一根 1820mm直徑的玻璃管 ， 截成 180200mm長(zhǎng) ， 洗凈烘干 。 ? 細(xì)菌在有氧環(huán)境中進(jìn)行代謝時(shí) ， 常產(chǎn)生超氧離子 (O)與過氧化氫 (H202)， 有強(qiáng)烈的殺菌作用 。 ? 隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定 ? 隨著工藝條件的改變作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整 。 種子罐級(jí)數(shù)的確定 ? 種子罐的級(jí)數(shù)愈少 ， 愈有利于簡(jiǎn)化工藝及控制 ? 并可減少種子罐污染雜菌的機(jī)會(huì) ? 減少消毒及值班工作量 ? 減少因種子罐生長(zhǎng)異常而造成的發(fā)酵波動(dòng) 。 在平時(shí)應(yīng)經(jīng)常分離試管菌種 ， 以防菌種衰退 、 變異和污染雜菌 。 ? 如果新菌種不純 ， 則需反復(fù)分離 ， 直至完全純粹為止 。 染菌的控制 ? （ 1） 染菌的原因 ? 歸結(jié)起來是：設(shè)備 、 管道 、 閥門漏損 、 滅菌不徹底； ? 空氣凈化不好； ? 無(wú)菌操作不嚴(yán)或菌種不純等 。 而新型的有機(jī)硅聚合物如硅油 、硅樹脂等 ， 則具有效率高 、 用量省 、 無(wú)毒性 、 無(wú)代謝性 ， 同時(shí)兼有提高微生物合成酶等多種優(yōu)良特性 ， 是一類有發(fā)展前途的消泡劑 。 ? （ 3） 培養(yǎng)過程的消泡措施 ? 機(jī)械法 ? 化學(xué)法 。 ? （ 2） 產(chǎn)生泡沫的原因 ? 通氣和機(jī)械攪拌使液體分散和空氣竄入 ， 形成氣泡； ? 培養(yǎng)基中某些成分的變化或微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生氣泡； ? 培養(yǎng)基中某些成分 (如蛋白質(zhì)及其他膠體物質(zhì) )的分子 ， 在氣泡表面排列形成堅(jiān)固的薄膜 。 ? 影響種子罐培養(yǎng)的主要因素包括營(yíng)養(yǎng)條件 、 培養(yǎng)條件 、 染菌的控制 、 種子 的級(jí)數(shù)和接種量控制等 。 ? 載體的取材必須耐蒸汽加熱或藥物滅菌 ， 多孔結(jié)構(gòu)既有足夠 的表面積 ， 又能允許空氣流通 。 (4)載體培養(yǎng) ? 載體培養(yǎng)脫胎于曲法培養(yǎng) ， 同時(shí)又吸收了液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) ， 是近年來新發(fā)展的一種培養(yǎng)方法 。 ⑥ 補(bǔ)料分批培養(yǎng)法 (流加法 ) ? 在分批培養(yǎng)時(shí) ， 不斷地供給培養(yǎng)基 ， 但所需產(chǎn)物不到一定時(shí)刻不放出的方法 ，稱為補(bǔ)料分批 培養(yǎng)法 。 從技術(shù)上也很難保證流入和流出速度的一致 。 ? 其特點(diǎn)是能使微生物處于恒定不變的環(huán)境中進(jìn)行長(zhǎng)期持續(xù)的培養(yǎng) ， 該系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)被叫做恒化器 。 目前多用在酒精 、 氨基酸 、 抗生素生產(chǎn)中 。 微生物周圍的環(huán)境隨時(shí)間而變化 ， 是一種非穩(wěn)態(tài)操作法 。 目前已大量用于露天大罐啤酒發(fā)酵 。 ? 用測(cè)定狀態(tài)變量的傳感器取得數(shù)據(jù) ， 經(jīng)電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行綜合分析 ， 再將其結(jié)果作為反饋調(diào)節(jié)的信號(hào) ， 將環(huán)境 (培養(yǎng)條件 )控制于給定的基準(zhǔn)內(nèi) 。 第二步是在微生物產(chǎn)生的某種酶作用下把第一步的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所需的氨基酸 ， 這 種生產(chǎn)方法又稱為酶轉(zhuǎn)化法 。 ? 在氨基酸的兩步法液體深層培養(yǎng)中 ， 每一步菌種和培養(yǎng)基等均不相同 。 ② 兩步法 ? ② 兩步法：酶制劑生產(chǎn)兩步法的特點(diǎn)是將菌體生長(zhǎng)條件 (營(yíng)養(yǎng)期 )與產(chǎn)酶條件 (自我繁殖期 )區(qū)分開來 。 ? e． 雷諾準(zhǔn)數(shù)相同 。 ? c． 比較單位液量所需的攪拌動(dòng)力 。 ? 放大過程中應(yīng)考慮： ? a． 氧傳遞速度相等 。 ? 但在好氧培養(yǎng)中 ， 大多以氧的供給為基準(zhǔn)進(jìn)行放大 。 ? 在厭氣發(fā)酵時(shí)問題歸結(jié)為如何從大型發(fā)酵罐中除去發(fā)酵熱 。 攪拌的目的除了溶解氧之外 ， 可使培養(yǎng)液中微生物均勻地分散在發(fā)酵罐內(nèi) ， 促進(jìn)熱傳遞 ， 以及為調(diào)節(jié) pH而使加入的酸和堿均勻分散等 。 ? ③ 通氣 、 攪拌：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐前先經(jīng)空氣過濾器除去雜菌 ， 制成無(wú)菌空氣 ， 而后由罐底部進(jìn)人 ， 再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡 。所以發(fā)酵罐具有蒸汽夾套 ， 以便將培養(yǎng)基和發(fā)酵罐進(jìn)行加熱滅菌 ， 或者將培養(yǎng)基由連續(xù)加熱滅菌器滅菌 ， 并連續(xù)地輸送于發(fā)酵罐內(nèi) 。 ? 特點(diǎn)是容易按照生產(chǎn)菌種對(duì)于代謝的營(yíng)養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣 、 攪拌 、 溫度 、 與培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件 ， 選擇最佳培養(yǎng)條件 。 (3)液體深層培養(yǎng) ? 用液體深層發(fā)酵罐從罐底部通氣 ， 送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解 。 ③ 通氣：無(wú)論淺盤或深層固體通風(fēng)制曲 ， 可以在曲房周圍使用循環(huán)的冷卻增濕的無(wú)菌空氣來控制溫濕度 ，并且能根據(jù)菌種在不同生理時(shí)期的需要 ， 靈活加以調(diào)節(jié) 。培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單。 其最大特點(diǎn)是固體曲的酶活力高 。 ? 固體培養(yǎng)又分為淺盤固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng) ， 統(tǒng)稱曲法培養(yǎng) 。 ? 優(yōu)點(diǎn)是不需要深層培養(yǎng)時(shí)的攪拌和通氣 ，節(jié)省動(dòng)力 。 ? 這種培養(yǎng)方法菌的生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)基深度有關(guān) ， 單位體積的表面積越大 ， 生長(zhǎng)速度也越快 。 2．大規(guī)模生產(chǎn)階段 ? (1)表面培養(yǎng) ? (2)固體培養(yǎng) ? (3)液體深層培養(yǎng) ? (4)載體培養(yǎng) (1)表面培養(yǎng) ? 表面培養(yǎng)是一種好氧靜置培養(yǎng)方法 ? 針對(duì)容器內(nèi)培養(yǎng)基物態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固態(tài)表面培養(yǎng) 。 ? (2)表面培養(yǎng)法 包括茄子瓶 、 克氏瓶或瓷盤培養(yǎng) 。 (三）主要培養(yǎng)方法及特點(diǎn) ? 1． 種子擴(kuò)大培養(yǎng)階段 ? (1)液體培養(yǎng)法 包括液體試管 、 三角瓶搖床振蕩或回旋式培養(yǎng) 。 ? 通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多 ， 它們生長(zhǎng)的環(huán)境必須供給空氣 ， 以維持一定的溶解氧水平 ， 使菌體迅速生長(zhǎng)和發(fā)酵 ， 又稱為好氣性發(fā)酵 。 二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 工業(yè)微生物菌種培養(yǎng)的類型 ? 工業(yè)微生物的培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型 。 ? 接種量過多也無(wú)必要 。 ? 大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點(diǎn)： ? ， 因而縮短了發(fā)酵周期 ， 提高了設(shè)備利用率 ， ? 2. 節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗 ， ? ， ? 一般都將菌種擴(kuò)大培養(yǎng) ， 進(jìn)行兩級(jí)發(fā)酵或三級(jí)發(fā)酵 。 種齡與接種量 ? 種子培養(yǎng)期應(yīng)取菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為宜 ，菌種過嫩或過老 ， 不但延長(zhǎng)發(fā)酵周期 ，而且會(huì)降低產(chǎn)量 。 ? 一般來說 ， 若培養(yǎng)罐深 ， 攪拌轉(zhuǎn)速大 ， 通氣管開孔小或多 ， 氣泡在培養(yǎng)液內(nèi)停留時(shí)間就長(zhǎng) ，氧的溶解速度就大 ， 而且在這些因素確定下 ，培養(yǎng)基的粘度越小 ， 氧的溶解速度也越大 。 ? 攪拌則能使新鮮氧氣更好地與培養(yǎng)液混合 ， 保證氧的最大限度溶解 ， 并且攪拌有利于熱交換 ， 使培養(yǎng)液的溫度一致 ， 還有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的分散 。 只有氧溶解的速度大于菌體的吸氧量時(shí) ， 菌體才能正常地生長(zhǎng)和合成酶 。 ? 通氣量與菌種 、 培養(yǎng)基性質(zhì) 、 培養(yǎng)階段有關(guān) 。 ? 不同微生物或同一微生物的不同生長(zhǎng)階段對(duì)通風(fēng)量的要求也不